Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Лабораторная диагностика. Единственный источник для выделения возбудителя — ткани очагов поражений (папиллом), где он содержится в форме полных вирионов в слое кератинизированных клеток; однако культивировать вирус in vitro не удаётся. Несмотря на очевидную иммуногенность основных Аг возбудителей (особенно «ранних» неструктурных белков), титры образующихся AT весьма низки, и проведение серологической диагностики лишено всякого смысла. В последнее время в практику активно внедряется метод гибридизации ДНК, особенно в диагностике остроконечных кондилом.

Поксвирусы

Семейство Poxviridae объединяет крупные и сложные вирусы, разделяемые на подсемейства Chordopoxvirus (вирусы оспы позвоночных) и Entomopoxvirus (вирусы оспы насекомых). Подсемейство Chordopoxvirus включает б родов, два из которых — Orthopoxvirus и Parapoxvirus — содержат виды, патогенные для человека и вызывающие различные заболевания с характерной везикулярной сыпью. Род Orthopoxvirus включает вирусы вакцины и натуральной оспы, род Parapoxvirus — вирусы узелков доярок, вирус контагиозной эктимы Шамб; в состав подсемейства также входят некоторые неклассифицированные вирусы, среди которых патогенны для человека вирусы оспы Тана и контагиозного моллюска. Для поксвирусов характерна кирпичеобразная форма (250-390x200-260 нм); геном представлен двухцепочечной молекулой ДНК; репликация поксвирусов осуществляется только в цитоплазме.

Натуральная оспа — одна из древнейших инфекционных болезней человека; первые упоминания об этом заболевании относятся к 3730-3710 гг. до н.э. (папирус Аменофиса I), позднее она упоминается в трудах Гиппократа, Галена и Фукидида. Первое полное описание натуральной оспы принадлежит перу персидского врача Абу-Бекр Мухаммеда бен-Закарии (910 г. до н.э.). В Европу возбудитель проник в VI в., где вызвал эпидемии в период Великого переселения народов и во времена крестовых походов; в Россию был занесён в XV-XVI вв., в Америку — в XVI в. Несмотря на то что античный мир (да и Европа в первые века н.э.) не знал крупных эпидемий, применяя метод вариоляции, или инокуляции (т.е. втирая или внося в ранку материал из пустул выздоравливающего больного лёгкой формой оспы), до открытия Джённером метода вакцинации (подразумевающим использование в качестве прививочного материала содержимого пустул больных коровьей оспой) европейские врачи были бессильны перед заболеванием. В отдельные годы смертность от оспы достигала 1,5 млн человек. Тем не менее натуральная оспа стала первым инфекционным заболеванием, против которого были разработаны эффективные методы иммунопрофилактики. Ещё в 1974 г. в Индии было отмечено 31 262 летальных исхода заболевания, последний «дикий» случай оспы на Земле зарегистрирован в 1977 г. в Сомали (в 1978 г. было отмечено два случая в Бирмингеме в результате лабораторного заражения), а через несколько лет ВОЗ объявила о ликвидации натуральной оспы.

Внутриклеточные, точнее, околоядерные включения в  клетках роговицы заражённого кролика впервые обнаружил Гварниёри (1892). Элементарные тельца возбудителя натуральной оспы в отделяемом везикул открыл Пашен (1906). Позднее было установлено наличие двух штаммов вируса, вызывающих заболевание, известное как классическая оспа (variola major) с летальностью, превышающей 50%, и алястрим (variola minor) с более лёгким течением и летальностью, не превышающей 1%. Возбудители идентичны по основным свойствам, отличительные особенности — способность вируса алястрима размножаться в куриных эмбрионах при более низкой температуре (37,5 °С), образовывать «бляшки» и проявлять цитопатический эффект в культуре куриных фибробластов при температуре 37 ⁰С. Возбудитель оспы — самый крупный вирус (220x300 нм), имеет кирпичеообразную форму с закруглёнными углами. В состав вируса входит 30 белков, более 10 из них — ферменты, катализирующие синтез нуклеиновых кислот.

Клинические проявления разделяют на три стадии — предвестников (2-4 сут), высыпаний (4-5 сут) и нагноений (7-10 сут); период выздоровления составляет 20-30 сут; по тяжести течения выделяют тяжёлую форму (геморрагическая и сливная оспа), среднюю (дискретная оспа) и лёгкую (оспа без сыпи и вариолоид). Инкубационный период натуральной оспы составляет 5-15 сут, но бывает короче при контактном заражении; начинается с репликации вируса в верхних дыхательных путях и регионарных лимфатических узлах и его проникновения в кровь (первичная вирусемия). Вторичная вирусемия означает окончание инкубационного периода и начало клинических проявлений.

Лабораторная диагностика. Наиболее эффективный метод — электронная микроскопия материала, полученного из везикул, что даёт возможность установить факт поксвирусной инфекции. При отсутствии соответствующего оборудования можно проводить световую микроскопию окрашенных мазков для выявления телец Пашена-Геарниери в цитоплазме эпителиальных клеток. Для дальнейшей идентификации проводят выделение вируса на фрагментах хорионаллан-тоисной оболочки куриных эмбрионов, в культурах фибробластов эмбриона человека либо клеток почек обезьян. Характер повреждений, а также предельная температура размножения вируса помогают отдифференцировать возбудитель натуральной оспы от вирусов оспы животных (обезьян, верблюдов, коров и т.д.). Серологические исследования включают постановку РН на куриных эмбрионах, РТГА и РПГА.

Эпидемиология. В организм человека вирус проникает воздушно-капельно, контактно или через повреждённую кожу.

Вирус оспы коров близок вирусу вакцины; основные отличия обусловлены температурой размножения (40 °С), характером бляшек на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов и способностью образовывать два типа включений. 1. Эозинофильные включения, не содержащие ДНК. 2. Включения, где размножается вирус. У человека заболевание возникает при контакте с больным животным; проявления аналогичны таковым при первичной вариоляции. В ряде случаев содержимое пузырьков может быть кровянистым.

Вирус оспы обезьян. Возбудитель открыт фон Магнусом (1959) во время вспышки оспо-подобного заболевания у обезьян в Копенгагене. Было показано, что по своим свойствам он мало отличается от прочих членов рода, а через 12 лет была установлена его способность вызывать оспоподобные поражения у людей. Практически все случаи (48) были зарегистрированы в маленьких населённых пунктах, расположенных в зоне тропических лесов Африки; от натуральной оспы заболевание отличает более низкая контагиозность и частота вторичных заражений. Тем не менее, до настоящего времени не установлено, являются ли обезьяны основным хозяином или промежуточным звеном между неизвестным резервуаром и человеком. Д. Прочие, патогенные для человека поксвирусы включают параоспенные вирусы контагиозной эктимы (болезни ОРФ), «узелков доярок» (паравакцины), а также неклассифицированные вирусы оспы Тана и контагиозного моллюска, сведения о которых представлены в табл. 33-6.

Оспа Тана встречается среди племён, обитающих в долине реки и озера Тана (Кения). Возбудитель передаётся при прямом контакте и, возможно, с укусами комаров.

Вирус контагиозного моллюска вызывает поражение кожных покровов у первично инфицированных детей и подростков; возбудитель передаётся контактно, через микротравмы кожи и слизистых оболочек, в том числе при половых сношениях.

Парвовирусы

Семейство Parvoviridae включает роды Parvovirus и Dependovirus, объединяющие распространённую группу мелких вирусов с голым геномом; свойства и своеобразная форма паразитирова-ния, характерные для их представителей, отводят им особое место в царстве вирусов. Первый представитель был открыт Килхэмом и Оливером в 1959 г., а к настоящему времени их известно более 30 видов; все парвовирусы разделяют на дефектные (не способны к самостоятельному размножению и нуждаются в «вирусах-помощниках») и недефектные (репродуцируются самостоятельно). Дефектные вирусы не патогенны для человека и объединены в род Dependovirus; основной известный патоген рода Parvovirus — вирус штамма В19; одни авторы относят к парвовирусам и вирус острого гастроэнтерита (агент Нбрволк) тогда как другие считают его членом рода Calicivirus. Возбудитель распространён повсеместно; в возрасте 16 лет приблизительно у 30% населения Земли можно обнаружить специфические AT в сыворотке крови. Пато-генность парвовирусов остаётся предметом дискуссии; тем не менее, штамм В19 требует особого внимания, т.к. его циркуляция в организме может приводить к развитию серьёзных нарушений.

Клинические проявления. Апластический криз. Показано, что инфицирование клеток-предшественников эритроидного ряда — пусковой механизм для развития апластических кризов у детей с серповидноклеточной анемией, гомозиготных по серповидноклеточному гену; у 37 из 40 обследованных пациентов выявлены Аг вируса В19 и AT к ним. Чувствительность клеток-предшественников обусловлена наличием эритроцитарного Р-Аг, одновременно являющегося рецептором для вируса и транскрибирующих факторов в клетках, облегчающих репликацию возбудителя. Инфекция вирусом В19 вызывает массированную гибель клеток-предшественников и приводит к развитию выраженной анемии с дефицитом клеток эритробластов в костном мозге. Erythema infectiosum («пятая болезнь»). Обычно умеренное заболевание, проявляющееся эритематозными, пятнисто-папулёзными высыпаниями, иногда сопровождающееся лихорадкой. Возбудитель — вирус В19. Сыпь появляется через неделю после начала заболевания. Инфекцию отличает умеренная контагиозность. Водянка плода. Некоторые авторы связывают подобную патологию с внутриутробным заражением вирусом В19.

Лабораторная диагностика. Выделение возбудителя лучше проводить на быстрорастущих культурах клеток; идентификацию вируса проводят электронной микроскопией, методом молекулярных зондов либо методом иммунофлюоресценции. Выявление AT проводят с помощью РСК и РН.

РНК-содержащие вирусы

Род Morbillivim

включает  вирусы кори, подострого склерозирующего  панэнцефалита, рассеянного склероза, чумы крупного рогатого скота и собак. Типовой вирус — вирус кори, вызывающий одно из самых высоко контагиозных вирусных заболеваний. Очевидно, что корь была известна с глубокой древности, но первое отдельное описание заболевания было сделано лишь в IX в. н.э. арабским врачом Разёсом; в Средневековье заболевание было распространено по всей Европе, откуда было завезено в Новый Свет и вызвало целые эпидемии среди туземцев. Подробное определение клинической картины кори принадлежит Сиденхэму (вторая половина XVII в.). Вирусная природа заболевания была доказана Эндерсоном и Голъдбергером (1911); первый штамм возбудителя выделен Эндерсом и Пйблзом (1954).

Антигенная структура вируса кори. Все известные штаммы принадлежат к одному серологическому варианту. Основные Аг вируса — три белка — гемагглютинин (Н), пептид F (представлен мажорным и минорным беками) и нуклеокапсидный белок (NP).  AT к гемагглютинину и F-протеину проявляют цитотоксическое действие, направленное против инфицированных клеток. Вирус кори имеет общие антигенные детерминанты с прочими морбилливирусами; у переболевших корью можно обнаружить AT к вирусам чумы крупного рогатого скота и собак.

Клинические проявления. Инкубационный период составляет 8-13 сут, в течение которых вирус размножается в эпителии дыхательных путей и ассоциированных лимфоидных тканях. Затем наступает стадия вирусемии, и вирус гематогенно диссеминирует. Вирусемию сопровождают продромальные симптомы, напоминающие ОРВИ, — риниты, фарингиты, конъюнктивиты (часто отмечают фотофобии), головные боли, небольшие повышения температуры, иногда диареи. Дифференцирующий признак — пятна Вельского—Филатова—Коплика на слизистой оболочке щёк; обычно они появляются за 24-36 ч до появления сыпи. Папулёзная сыпь сначала появляется на голове (на лбу, за ушами), затем распространяется на тело и конечности. Появление сыпи — проявление взаимодействия иммуно-компетентных клеток и AT с инфицированными клетками. Подобно прочим парамиксовирусам, возбудитель кори способен вызывать слияние клеток, что обусловлено экспрессией F-белка на их мембранах; образующиеся гигантские клетки, или синцитий, можно встретить в различных тканях организма.

Необычные формы коревой инфекции. Атипичная корь Иногда наблюдают у новорождённых, что обусловлено наличием материнских сывороточных противокоревых AT (IgG). Заболевание характеризуется удлинением инкубационного периода, отсутствием типичных признаков и стёртым течением. Также атипично корь протекает у детей, получавших в инкубационном периоде антибиотики. В подобных ситуациях все стадии заболевания удлиняются и протекают достаточно стёрто. Митигированная корь. Подобную форму наблюдают у лиц, получивших инъекцию противокоревого Ig (а иногда и после введения простого у-глобулина, содержащего противокоревые AT). Заболевание характеризуется удлинением инкубационного периода, атипичной клинической картиной (раннее появление сыпи, её исчезновение без пигментации, отсутствие интоксикации и т.п.).

 Лабораторная диагностика. При типичных формах диагностику проводят по клиническим признакам, однако у подростков и взрослых корь часто протекает стёрто. Кроме того, целый ряд инфекций сопровождается кожными высыпаниями и гиперреактивными проявлениями (например, инфекционный мононуклеоз, краснуха, энтеровирусные инфекции, рик-кетсиозы). Для дифференцирования проводят исследование высыпаний (характер, время появления, локализация), а также тщательно анализируют данные анамнеза (позволяющие отдифференцировать сывороточную болезнь и медикаментозно-токсические сыпи). Лабораторная диагностика включает: Обнаружение многоядерных клеток и Аг возбудителя (в реакции иммунофлюорес-ценции) в отделяемом носоглотки. Выделение вируса на первично-трипсинизированных культурах клеток почек обезьян или эмбриона человека. Выявление нарастания титров AT (Нейтрализующих, комплементсвязывающих и антигемагглютинирующих) в период реконвалесценции.

Эпидемиология. Корь распространена повсеместно, а в некоторых странах она эндемична. Естественный резервуар — человек и приматы. Основной путь передачи — воздушно-капельный, реже контактный (возбудитель также выделяется с мочой); наибольшую эпидемическую опасность больной представляет в продромальный период и период кожных высыпаний.

Тогавирусы

Вирус краснухи по своим фундаментальным свойствам близок к тогавирусам, но в отличие от них, в его состав входит нейраминидаза; патогенен для ограниченного круга позвоночных (например, Масаса rhesus и М. mulatto), отдельные штаммы проявляют тератогенный эффект у кроликов. У человека вызывает краснуху — острое инфекционное заболевание (также известно как «германская корь»), обычно наблюдаемое у детей. Возбудитель выделен Хйро и Тасака (1938), размножается в различных культурах клеток (но не в клетках членистоногих). Этапы репликации аналогичны таковым у тогавирусов, но сборка нуклеокапсида происходит не в цитоплазме. В большинстве клеточных культур вирус не проявляет цитопатического действия, поэтому при диагностических исследованиях индикатор — интерференция с каким-либо цитопатогенным вирусом. Вирус агглютинирует эритроциты птиц (голубей, гусей и др.) и проявляет гемолитическую активность, что позволило разработать диагностическую реакцию радиального гемолиза, а также метод титрации AT по задержке гемолиза и VP,_₃ у вируса краснухи

Клинические проявления. Типичная форма. Инкубационный период длится 11-23 дня (в среднем 18 сут); продолжительность продромального периода варьирует от нескольких часов до 1-2 дней. Последний сопровождается незначительным подъёмом температуры, слабым насморком и кашлем. Типичным симптомом, предшествующим появлению сыпи, служит лимфаденит обычно шейных и затылочных узлов; последние достигают размеров горошины, плотные и болезненные. Характерный признак заболевания — пятнисто-папулёзная сыпь бледно-розового цвета, наиболее обильная на разгибательных поверхностях конечностей, спине и ягодицах. Реже наблюдают экзантемные пятнышки на слизистой оболочке зева (но никогда не бывает пятен Белъского-Фшатова-Коплика). Через 2-3 дня кожные элементы исчезают, не оставляя пигментации и шелушения. Взрослые переносят краснуху тяжелее: температура может достигать 39 ⁰С, возможны сильные головные боли и миалгии, выраженные катары слизистой оболочки носа и конъюнктивы.