Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

  Лабораторная диагностика основана на выявлении характерных признаков и гистологическом исследовании биоптатов; следует дифференцировать с туберкулёзом, лепрой, фибромами, ксантомами и келоидами.

Простейшие

Toxoplasma gondii

Вид включён  в состав типа Apicomplexa, класса Sporozoea, отряда Eucoccidiida, подотряда Eimeriina, семейства Eimeriidae. Вызывает токсоплазмоз — паразитарную инфекцию, характеризующуюся хроническим течением, поражением нервной системы, увеличением печени и селезёнки, частым поражением скелетных мышц и миокарда. Toxoplasma gondii — внутриклеточный паразит, морфологически напоминающий вытянутую дольку апельсина. Длина 4-7 мкм, один конец закруглён; по Романовскому-Гимзе цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядро — в красно-фиолетовый. В 1908 г. впервые возбудитель выделен Ш. Ни-колем и А. Мансб в Тунисе у грызунов гбнди (Ctenodactylus gundi) и А. Сплендоре в Бразилии у кроликов. Заболевание распространено повсеместно, возбудитель выделен практически от всех млекопитающих и многих птиц. Заражение человека происходит алиментарным путём при проникновении ооцист или тканевых цист (при употреблении сырых или полусырых мясных продуктов, но чаще с немытыми овощами и фруктами), реже через кожу (при разделке туш, работах с лабораторным материалом) и трансплацентарно от беременных (в среднем 1:2700 нормальных родов). Вероятность заболевания токсоплазмозом увеличивается с возрастом. Серологическое обследование установило инфицированность Т. gondii 50% взрослых американцев. Инфицированность населения разных стран составляет от 4 до 68%.

Жизненный цикл включает стадии полового и бесполого размножения. Первичные и основные хозяева — домашние кошки и прочие представители семейства кошачьих, в организме которых происходит половое размножение возбудителя.  Первичное заражение кошек происходит при поедании грызунов, содержащих ооцисты, из которых выходят паразиты (спорозбиты), проникающие в клетки кишечника и превращающиеся в трофозбиты, которые размножаются бесполым путём (шизогония).  Половое размножение возбудителя также происходит в клетках слизистой оболочки кишечника. Образовавшиеся в результате бесполого размножения мерозбиты разрушают эпителиальные клетки и проникают в подлежащие слои кишечной стенки, где трансформируются в гаметоциты. Слияние разнополых гаметоцитов приводит к образованию зиготы (ооцисты).  Ооцисты — округлые образования с плотной бесцветной двухслойной оболочкой диаметром 9-14 мкм. Из организма кошек выделяются с испражнениями. Ооцисты хорошо сохраняются в почве, животные, в том числе грызуны заражаются при их заглатывании. Весь цикл репродукции в организме окончательного хозяина занимает 1-3 нед.  Промежуточные хозяева. Токсоплазмы поражают человека, многих диких и домашних животных и птиц, в организме которых паразит проходит бесполый цикл развития и размножения. Из проникших в организм ооцист выходят паразиты, активно поглощаемые макрофагами. Фагоцитоз носит незавершённый характер. Возбудитель (спорозоиты) диссеминирует по лимфатическим сосудам с макрофагами. В цитоплазме макрофагов начинается первый этап шизогонии. На более поздних этапах шизогонии макрофаги погибают, и высвободившиеся паразиты (тахизбиты) инвазируют в клетки организма (подвержены любые ядросодержа-щие клетки).  Для острой стадии инфекции характерно образование в поражённых клетках скоплений токсоплазм (псевдоцисты). При их разрушении паразиты инвазируют соседние клетки, и цикл повторяется. Паразитемия развивается только в острой стадии. При хронических процессах возбудитель образует истинные цисты с плотной оболочкой (средний размер 100 мкм). Каждая циста содержит более сотни паразитов (брадизбиты), расположенных так плотно, что на препаратах видны одни ядра. Эта фаза — конечная для паразита в организме всех животных, исключая окончательного хозяина, в котором завершается жизненный цикл.

Клинические проявления. Большинство случаев токсоплазмоза протекает бессимптомно. На характер проявлений существенно влияет общее состояние организма. У здоровых людей токсоплазмоз может проявляться умеренной лимфаденопатией (обычно шейных лимфатических узлов).  Прочие проявления могут включать фарингит, лихорадку, сыпь, гепатоспленомегалию и атипичный лимфоцитоз. Часто заболевание имитирует инфекционный мононуклеоз. В тяжёлых случаях можно наблюдать менингоэнцефалит, пневмонию, хориоретинит, эндокардит и поражения внутренних органов. У лиц с иммунодефицитами, включая СПИД, заболевание приобретает тяжёлый, преимущественно фатальный характер.  Наиболее часто наблюдают активизацию латентной инфекции на фоне приёма иммунодепрессантов.  У подобных пациентов острое заболевание может приводить к некротизирующему энцефалиту, эндокардиту и пневмониям.  Наиболее частое и грозное осложнение — энцефалит (выявляют у 50% больных), дающий до 90% всех летальных исходов при токсоплазмозе.  Врождённый токсоплазмоз. При заражении беременной женщины возбудитель проникает в плод через плаценту. В результате плод либо погибает (выкидыш, мертворождение), либо рождается с симптомами острого врождённого токсоплазмоза — интоксикацией, лихорадкой, желтушностью, поражениями печени, селезёнки, лимфатических узлов и ЦНС. Нарушения более выражены при заражении в I триместр беременности.

Лабораторная диагностика. Выявление возбудителя проводят микроскопией полученных образцов, возможно выделение токсоплазм из биоптатов и биологических жидкостей с последующим культивированием на 10-11-суточных куриных эмбрионах или клетках HeLa. В лечебных учреждениях наиболее доступны серологические тесты на выявление возбудителя. Микроскопия. При подозрении на токсоплазмоз исследуют кровь, СМЖ, пунктаты лимфатических узлов, остатки плодных оболочек, а также трупный и биопсийный материалы. К результатам микроскопии следует относиться с осторожностью, т.к. необходимо дифференцировать острую инфекцию от латентной хронической. Мазки и срезы окрашивают по Романовскому-Гимзе или Райту. Выявление Т. gondii в тканях мозга осуществляют электронной микроскопией либо различными иммунофлюоресцентными методами.  Биологическая проба. Наибольшую ценность имеет выделение токсоплазм, полученных от животных, заражённых клиническим материалом. Белым мышам парентерально вводят кровь лиц, подозрительных на наличие токсоплазм, что помогает выявить острую форму болезни микроскопией образцов тканей заражённых животных. Серологическая диагностика. AT к токсоплазмам выявляют с помощью РСК, РПГА, латекс-агглютинации. Определение IgM. AT появляются на ранних сроках заболевания. Этот факт используют для диагностики наследственного токсоплазмоза, т.к. IgM не проходят через плаценту и их наличие у новорождённого свидетельствует об инфицировании. AT можно идентифицировать методом непрямой иммунофлюоресценции. Титры, равные 1:80 и выше, указывают на наличие токсоплазмоза. Тесты относительно неспецифичны, трудно поддаются стандартизации и в широкой практике не применяются у новорождённых и пациентов с иммунодефицитами.  Определение IgG. Образование AT достигает своего пика на 4-8 нед. Обычные титры AT -1:1000 и выше. Наибольшее распространение получил метод непрямой иммунофлюоресценции. Высокоспецифична и чувствительна проба Сэбина-Фельдмана на окрашивание токсоплазм. Тест технически труден и не совсем безопасен, но до развития иммунофлюоресцентных методов сохранял своё значение как самый надёжный способ серологической диагностики. Необходимо использовать парные сыворотки; 4-кратное увеличение титров свидетельствует об острой инфекции. В настоящее время разработаны ИФА и РИА, основанные на выделении IgG. Особенно широко их используют у новорождённых и пациентов с иммунодефицитами. Наиболее доступный способ диагностики — кожная проба с токсоплазмином. Проба положительна с 4 нед заболевания и сохраняется в течение многих лет. Положительный результат свидетельствует лишь о заражении в прошлом и указывает на необходимость более тщательного обследования.

Trichomonas vaginalis

Трихомонады — простейшие семейства Trichomonadidae, в организме человека обитают Т. tenax ( Т. elongata) — комменсал ротовой полости (обычно выделяемый из зубных камней и кариозных дефектов зубов), Т. hominis — комменсал толстой кишки (в больших количествах выделяют при диспептических расстройствах; очевидно, играет определённую роль в осложнениях заболеваний толстой кишки у детей младшего возраста) и Т. vaginalis, вызывающая трихомоноз (трихомониаз). Как влагалищные паразиты Т. vaginalis первично выделены Донне в 1837 г. Для заболевания характерны комплексные поражения различных участков мочеполовой системы; выделяют из влагалища и мочеиспускательного канала женщин, мочеиспускательного канала и предстательной железы мужчин (человек единственный природный хозяин).

 Морфология и культуральные свойства. Возбудитель имеет грушевидное тело 14-30 мкм длиной, удлинённое ядро, смещённое в передний конец, и вакуолизированную цитоплазму. На переднем конце имеются 4 жгутика и ундулирующая мембрана, доходящая только до заднем конце в виде шипика. Т. vaginalis хорошо растёт на искусственных средах (например, L.E.S. либо на специальных средах) с рН 5,5-6,0 в анаэробных условиях.

 Эпидемиология. Заболевание передаётся половым путём и распространено повсеместно; в США ежегодно заболевают около 3 млн женщин. Статистика РФ указывает аналогичные цифры. Заражения при бытовых контактах регистрируют очень редко. В среднем до 25% женщин, ведущих активную половую жизнь, инфицированы трихомонадами. Риск заражения коррелирует с частотой половых контактов. Заболеваемость среди мужчин сопоставима с распространённостью трихомоноза среди женщин.

 Клинические проявления. У женщин Т. vaginalis вызывает острый или подострый вагинит. Заболевание носит перемежающийся характер — симптомы угасают при менструациях и беременности, что связано с переходом обычно кислого рН влагалища в щелочной, неблагоприятный для трихомонад. Обычны зуд, жжение, дизурические расстройства, боли при половых актах. Выраженность симптомов варьирует в течение недель и месяцев. Примерно в 75% случаев «свежего» трихомоноза наблюдают серозно-гнойные выделения. Скопления экссудата локализованы на задней стенке свода влагалища. Стенки влагалища гиперемированы, имеют характерный «земляничный» вид. Характер и вид выделений редко соответствуют их классическому определению как жидких, желтоватых и пенистых.  При обследовании наблюдают воспалительные изменения слизистой оболочки влагалища и шейки матки. Для тяжёлых форм характерны множественные точечные кровоизлияния и эрозии слизистой оболочки. В настоящее время редко наблюдают типичные для трихомоноза гранулематозное воспаление и разрыхление эпителия шейки матки.  У мужчин обычны поражения мочеиспускательного канала и предстательной железы, иногда эпидидимит. Симптомы обычно стёртые, что связано с удалением значительной части трихомонад при мочеиспускании. Включают дизурические расстройства и незначительные выделения. Хронизация процесса почти в 100% случаев приводит к развитию хронического простатита.

 Лабораторная диагностика включает микроскопию нативных и окрашенных метилено-вым синим или по Романовскому-Гимзе препаратах. Для этого готовят мазки отделяемого мочеиспускательного канала из осадка центрифугированной мочи.  Определённые сложности представляет идентификация неподвижных паразитов, находящихся внутри эпителиальных клеток. Один из основных признаков внутриклеточных форм — ромбовидное ядро (косточка сливы).  В хронических случаях возбудитель может исчезать из мочеполового тракта и локализоваться в предстательной железе, что требует микроскопического исследования её секрета. Отрицательные результаты микроскопии не следует рассматривать как окончательные, обследование необходимо повторить через 2-3 нед.  Для оптимизации диагностики желательно провести посев выделений или секрета предстательной железы на питательные среды.

Род Leishmania

Все виды —  облигатные внутриклеточные паразиты млекопитающих; у человека некоторые  виды вызывают лейшманиозы — группу инфекций с чётко очерченными клиническими проявлениями. Поражения традиционно разделяют на 4 больших типа: висцеральный лейшманиоз (кала-азар), кожный лейшманиоз Старого Света, кожный лейшманиоз Нового Света, а также выделяемый в отдельную форму кожно-слизис-тый лейшманиоз. Каждый тип клинически и географически вполне определён; этиологические агенты морфологически тождественны, передача осуществляется различными видами москитов. После выздоровления развивается пожизненная штаммоспецифическая невосприимчивость. Признаки развития иммунных реакций появляются уже на ранних стадиях болезни положительной пробой Монтпегбро. Первые упоминания о лейшманиозах встречаются в трудах античных и древнекитайских врачей. В Европе первые сведения о лейшманиозах были получены от Рассела, давшего описание «восточной язвы» в 1756 г. Впервые подробное описание лейшманий (L. tropica), вызывающих кожный лейшманиоз, дал П.Ф. Боровский в 1897 г. Виды рода Leishmania во многом морфологически идентичны, что затрудняет классификацию, далёкую от совершенства и в настоящее время. Большинство современных учебных пособий использует классификацию Ламсдена (1974), выделяющую 4 группы возбудителей.

 Возбудители. Группа  L   tropica  [L.  tropica подвид  tropica (L. tropica подвид minor), L. tropica подвид major] — возбудители кожных лейшманиозов Старого Света (Африка, Азия). К этой же группе можно отнести недавно выделенную L. aethiopica — эндемичный возбудитель кожного лейшманиоза в Эфиопии.   Группа L. mexicana (L. mexicana подвид mexicana, L. mexicana подвид amazoniensis, L. mexicana подвид pifanoi, а также L. mexicana подвид venezuelensis и, возможно, L. mexicana подвид garnhami) — возбудители кожных и диффузных кожных лейшманиозов Нового Света. К этой группе также относят L. peruviana и L. uta — эндемичных возбудителей кожных лейшманиозов в высокогорных районах Анд и Кордильер.   Группа L. braziliensis (L. braziliensis подвид braziliensis, L. braziliensis подвид guyanensis, L. braziliensis подвид panamensis) — возбудители кожно-слизистых лейшманиозов Нового Света.   Группа L. donovani (L. donovani подвид donovani, L. donovani подвид infantum, L. donovani подвид archibaldii) — возбудители висцеральных лейшманиозов Старого Света.

Биологические особенности. Морфология. Лейшмании проходят 2 стадии развития: безжгутиковую и жгутиковую. Жгутиковые формы (промастигбты) — подвижные, развиваются в теле насекомого хозяина-переносчика (москита). Тело веретенообразное, длиной 10-20 мкм. Ки-нетопласт имеет вид короткой палочки и расположен в передней части тела; жгутик длиной 15-20 мкм. Размножаются продольным делением. Безжгутиковые формы (амастигбты) — паразитируют в клетках млекопитающих; клетки овальные, длиной 2-6 мкм, содержат кариосому и ядро. Ядро округлое, занимает 1/3 клетки, при окраске по Романовскому—Гимзе цитоплазма голубовато-сиреневая, ядро и кинетопласт красно-фиолетовые. Размножаются простым делением. Жизненный цикл. Лейшманиозы относят к группе трансмиссивных инфекций, переносчиками служат кровососущие москиты родов Phlebotomus и Lutzomyia. Переносчики заражаются при кровососании на больных людях и животных. В первые же сутки заглоченные амастиготы превращаются в кишечнике в промастиго-ты, начинают делиться и через 6-8 сут скапливаются в глотке москита. При укусе человека или животного возбудитель проникает в ранку и внедряется в клетки кожи или внутренних органов (в зависимости от вида лейшманий). Определённая роль в диссеминировании возбудителя принадлежит мононуклеарным фагоцитам. После инвазии в клетки млекопитающих промастиготы превращаются в амастиготы.

Кожный лейшманиоз Старого Света  (пендинская или сартская язва, алеппский, багдадский или восточный фурункул). Выделяют антропонозный, или городской (болезнь Боровского], возбудитель (L. tropica подвид major) и зоонозный, или пустынный (возбудители — L. tropica подвид tropica и L. aethiopica) лейшманиозы.

Эпидемиология. Естественный резервуар — мелкие грызуны (мыши, крысы, даманы), переносчики — москиты Phlebotomus papatasii (основной переносчик, этиологическая роль доказана Адлером и Теодором в 1926 г.), P. duboscqi, P. salehi, P. longpipes и P. pedifer. Кожный лейшманиоз — эндемичная инфекция с наибольшей заболеваемостью в осенние месяцы. В эпидемиологическом плане характерно ползучее распространение, постепенно охватывающее отдельные группы населения. Подавляющее большинство очагов кожного лейшманиоза расположено в районах, граничащих с пустынями с низким стоянием подземных вод.

Клинические проявления. Инкубационный период длится от 2 нед до 5 мес. Папулёзная стадия. По окончании инкубационного периода на коже образуется узел, увеличивающийся до размеров лесного ореха. Отмечают увеличение регионарных лимфатических узлов.  Папулы изъязвляются; дно язвы покрыто грануляционной тканью, края воспалённые, возможно формирование дочерних поражений. В зависимости от возбудителя наблюдают формирование «сухих» (L. tropica подвид major) или «мокрых» (L. tropica подвид tropica) безболезненных язв. Через 3-12 мес наблюдают спонтанное излечение с образованием грубого пигментированного шрама («печать дьявола»).   Рецидивирующий (волчаночный) лейшманиоз — инфекция, вызванная L. tropica подвид tropica, с частичным заживлением очагов поражения и интенсивным образованием гранулём и частым развитием сопутствующих поражений, способствующих образованию гранулематозной ткани без признаков излечения, иногда в течение многих лет.