Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Лабораторная диагностика включает выделение возбудителя в культурах клеток, но более распространены методы серологической диагностики. Серологическая диагностика у детей. Обычно используют наборы для TORCH-инфекций, т.к. у новорождённых и грудных детей достаточно трудно дифференцировать врождённые инфекции. Наличие IgM указывает на перенесённую инфекцию. Следует помнить, что отрицательный результат не всегда окончателен. Выявление AT также возможно в РСК, РТГА, методами ИФА и РИА. Для окончательной диагностики ставят реакцию радиального гемолиза в геле и РН гемолитической активности. Серологическая диагностика у беременных. Проводят сразу после контакта с больным; наличие AT в крови указывает на заражение, предшествующее контакту. Выявление IgM свидетельствует о текущей или недавней инфекции. При отрицательном результате беременную следует обследовать через 28 сут (18 сут — продолжительность инкубационного периода плюс 10 сут — на появление достаточно высоких титров AT). Выявление AT при вторичном исследовании указывает на факт инфицирования.

Вирус иммунодефицита

Морфология. ВИЧ имеют сферическую форму, их размеры не превышают 100-120 нм в диаметре (рис. 34-1). По своей структурной организации они близки к лентивирусам. Наружная оболочка образована двойным липидным слоем с гликопротеиновыми «шипами». Каждый содержит две субъединицы (gp41 и gp!20); первый белок пронизывает липидный слой насквозь. Под оболочкой расположена сердцевина цилиндрической или конусовидной формы; её образуют белки р18 и р24. В сердцевине располагаются РНК, внутренние белки (р7 и р9) и обратная транскриптаза.

Для описания основных структурных белков ВИЧ  используют две номенклатурные системы: первая базируется на химической природе и молекулярной массе белков, т.е. белки обозначают буквой «р>>, а гликопротеины «gp» — с указанием молекулярной массы. Другая основана на топографии белка и использует сокращения МА (матриксный), СА (капсидный), SA (поверхностный), ТМ (трансмембранный) с последующим указанием молекулярной массы (например, МА17). 1. Гликопротеин gp160 состоит из трансмембранного фрагмента (gp41), нековалентно связанного с основным внешним гликопротеином (gp120). Gp120 — высокоиммуногенный белок, содержащий консервативные и гипервариабельные участки, а также область, связывающую молекулу CD4 Т-лимфоцитов. gp41, вероятно, — аналог индуцирующих слияние белков парамик-совирусов; проникновение ВИЧ в клетку может включать присоединение gp120 к CD4 и слияние, обусловленное gp41. Кроме того, gp41 может опосредовать проникновение вируса в клетки с дефицитом рецепторов CD4.

Капсид ВИЧ  образует белок р24 (или СА24). Матриксный белок р17 (или МА17) формирует прослойку между сердцевиной вириона и внешней оболочкой. Белки рб и р7 связывают нуклеиновые кислоты. Ферменты. В состав ВИЧ входят обратная транскриптаза (димер из рбб и р51) и эндонуклеаза (р31).

Геном ВИЧ  образуют две нити +РНК, соединённые вблизи их 5'-терминалей; включает следующие гены: Ген gag кодирует полипротеин, постсинтетически расщепляющийся на отдельные иммуно-генные структурные белки (группоспецифичные Аг). Ген pol кодирует синтез обратной транскриптазы (ревертазы). Среди всех обратных транскриптаз вирусов ревертаза ВИЧ наиболее активна в плане сбоев генетического кода. По последовательностям РНК изоляты ВИЧ из различных пассажей одного вируса могут различаться более чем на 20%. Продукт гена pol имеет различную ферментативную активность: он может выступать в качестве полимеразы, рибонуклеазы и эндонуклеазы. Интегративная/лигирующая эндонуклеазная активность — критический момент для внедрения вирусной ДНК в геном хозяина.

Гены, локализованные вблизи соединения gag pol, считываемого иначе, чем гены структурных белков, кодируют протеазу, вырезающую саму себя из большой полипептидной цепи и разрезающую оставшийся полипротеин-предшественник на прочие отдельные протеины и пептиды. Ген env кодирует гликопротеины оболочки.

Регуляторные гены. Ген tat (трансактиватор транскрипции) кодирует белок (р!6), связывающийся с TAR-регионом вблизи 5'-окончания образующейся вирусной цепи РНК. Продукт гена в десятки раз увеличивает скорость транскрипции структурных и регуляторных белков. TAR-регион (отвечающий за трансак-тиваторную последовательность) продолжает транскрипцию цепи. Очевидно, ген tat также влияет на посттранскрипционные события и активизирует транскрипцию клеточных генов. Ген rev (регулятор экспрессии вирусных белков) кодирует второй белок (р!9), активирующий экспрессию генов структурных белков ВИЧ-1. Продукт гена также регулирует транскрипцию, но либо структурных, либо регуляторных белков. Подобная способность к переключению синтеза регуляторных белков на капсидные способствует более быстрому образованию дочерних популяций. Ген nef (отрицательный фактор экспрессии) кодирует белок, способный уменьшать экспрессию вируса и переводить инфекцию в латентное состояние. Однако в некоторых клеточных линях ген nef отвечает за усиление репликации. По бокам от вирусных генов расположены длинные концевые повторяющиеся (фланкирующие) последовательности (LTR). Область LTR содержит ТАТА-блоки и валентные участки для ядерносвязывающегося белка, иначе известного как ядерный фактор kB (NFkB). Продукт гена tat может повышать синтез NFkB или модифицировать NFkB, увеличивая его сродство к фланкирующим последовательностям LTR.

Клинические проявления. После вариабельного по длительности бессимптомного периода у 80-100% пациентов развивается симптоматическая ВИЧ-инфекция, а около 50-100% пациентов обречены на развитие клинически выраженного СПИДа. А. В настоящее время выделяют пять клинических стадий ВИЧ-инфекции.

Острое заболевание, ассоциированное  с сероконверсией. Инкубационный период обычно продолжается 2-4 нед, характеризуется выраженной вирусемией и возможностью диссеминирования возбудителя при отсутствии AT.  Клинические проявления. Симптомы аналогичны таковым при инфекционном мононуклеозе или простуде. Наиболее часто отмечают лихорадку, лимфангииты, боль в горле, миалгии, головную боль, недомогание, иногда пятнисто-папулёзные высыпания. Симптомы наблюдают у 53-93% больных, но отсутствие патогномоничных признаков часто приводит к диагностическим ошибкам. У большинства пациентов первичные проявления могут исчезать. Тем не менее головная боль и аденопатия могут сохраняться длительное время.

  Лабораторные исследования. В течение латентного периода между заражением и образованием значимых титров AT, факт ВИЧ-инфекции можно установить по наличию вируса и вирусных Аг. Наиболее эффективные методы — выделение вируса и выявление вирусной РНК в ПЦР, но они не доступны для обычной лабораторной практики. Применение ИФА для обнаружения вирусных Аг (например, проба на р24) ограничивает его низкая чувствительность. AT к р24 обычно появляются через 6 нед после заражения (AT к gp!20 и gp41 обычно обнаруживают раньше). Поскольку AT во время первичных проявлений инфекции обычно отсутствуют, то серонегативный больной, относящийся к группе повышенного риска, должен пройти повторный тест спустя б нед. В редких случаях сероконверсия может развиваться через год или более.

Бессимптомная ВИЧ-инфекция. Больной остаётся сероположительным при отсутствии симптомов либо минимальных проявлениях (обычно диффузной реактивной лимфаденопа-тии и головной боли).

Лабораторные исследования. Прогрессирующее уменвшение количества CD4⁺ лимфоцитов — наиболее достоверный индикатор иммунодефицита. Поскольку у различных индивидуумов количество CD4* лимфоцитов варьирует, необходимо проводить повторные исследования.  Корреляция между количеством CD4* клеток и тяжестью клинических симптомов далеко не полная. Некоторые индивидуумы с экстремально низким их количеством не имеют выраженных симптомов, а у других, с большим количеством CD4* клеток, развиваются симптомы СПИДа.  Обнаружение р24-Аг в крови коррелирует, с развитием СПИДа, т.к. косвенно отражает уровень репликации возбудителя, неконтролируемой иммунной системой. В динамике ВИЧ-инфекции всё чаще выявляют маркёры активации лейкоцитов, включающие:  Молекулы, выделяющиеся при активации Т-лимфоцитов (р„-микроглобулин, растворимый рецептор ИЛ-2 и растворимый CD8).  Молекулы, образующиеся при активации моноцитов (неоптерин). Синтез HLA-DR и CD38 (CD38 синтезируют только CD8* лимфоциты).  Постоянное возрастание содержания Р₂-микроглобулина и неоптерина обычно показательно для слабого развития симптоматической инфекции. Сочетание уменьшения количества CD4* клеток и повышения уровня (3₂-микроглобулина или неоптерина либо снижение CD4⁺клеток и обнаружение Аг р24 свидетельствует о более обоснованном прогнозе обязательного развития СПИДа, чем просто низкий уровень CD4* лимфоцитов. Пациент без выраженных симптомов должен быть обследован, и, если это необходимо, ему проводят лечение заболеваний, часто встречающихся у ВИЧ-инфицированных (например, сифилиса, гепатита В и туберкулёза). Целесообразность проведения химиотерапии туберкулёза или иммунопрофилактики ангин и пневмококковых инфекций соответствующими вакцинами остаётся на усмотрении врача. Также рекомендованы серологические исследования на токсоплазмоз, т.к. на поздних стадиях болезни они могут приобретать фатальный характер. Среди жителей городов 8-16% ВИЧ-инфицированных сероположительны, у 80% токсоплазмоз развивается снижения количества числа CD4⁺ клеток ниже 100/мм³.  У ВИЧ-положительных женщин рекомендуется исследовать биоптаты кожных покровов перианальной области, что обусловлено их повышенной инфицированностью па-пилломавирусами.

Ранняя симптоматика ВИЧ-инфекции. О переходе бессимптомной ВИЧ-инфекции в симптоматическое заболевание свидетельствуют лихорадка, повышенное ночное потоотделение, слабость, хроническая диарея, генерализованная лимфаденопатия и головная боль при отсутствии какой-либо специфической или оппортунистической инфекции. Диарея наиболее вероятно вызвана прямым инфицированием ВИЧ слизистой оболочки кишечника.  Генерализованная лимфаденопатия может быть выраженной у одних пациентов и менее явной у других.

 Саркома Капоши может развиваться довольно рано. Согласно одной теории, этиология поражений связана с избыточным высвобождением ИЛ-6, ИЛ-1, TNF-cc и онкостатина М активированными макрофагами, действующими синергически и активирующими развитие сосудистых пролиферативных нарушений, типичных для саркомы.  Другая теория связывает возникновение опухоли с активностью ВПГ 8 типа. В динамике могу появиться анергия и другие лабораторные доказательства иммунодефицита. Развиваются некоторые сопутствующие инфекции, особенно оральный кан-дидоз, лейкоплакия слизистой оболочки рта (часто бессимптомная), инфекции верхних и нижних дыхательных путей и заболевания периодонта.

 Поздняя симптоматическая стадия ВИЧ-инфекции. При прогрессирующем уменьшении количества CD4⁺ клеток риск возникновения оппортунистических инфекций возрастает.  Основные проявления оппортунистических инфекций — пневмоцистная пневмония (заболеваемость значительно возрастает при снижении количества С04⁺лимфоцитов ниже 200/мм³) и токсоплазмоз с частым поражением мозга. При уменьшении содержания CD4⁺клеток ниже 100/мм³ возрастает частота инфицирования комплексом Mycobacterium avium-intracellulare или ЦМВ, часто развиваются кан-дидозы пищевода, криптококковые пневмонии и менингиты, рецидивирующие герпетические инфекции на фоне общего истощения. Высвобождение TNF-OC (кахектина) вносит свой вклад в синдром истощения (известен как «болезнь худобы» в Африке), характерный для прогрессирующего СПИДа.

 Прогрессирующая ВИЧ-инфекция. Снижение содержания CD4⁺лимфоцитов ниже 50/мм³ приводит к полной дисфункции иммунной системы. В этой стадии могут развиваться все виды оппортунистических инфекций.

СПИД. На развитие СПИДа указывают следующие проявления у ВИЧ-инфицированного. Оппортунистические инфекции. Прогрессирующий синдром истощения у взрослых или задержка развития у подростков.  Наиболее часто у детей и подростков со СПИДом выявляют необычно частые инфекции, не рассматриваемые как оппортунистические, например рецидивирующую бактериальную пневмонию или туберкулёз лёгких. Специфичными признаны некоторые неопластические заболевания, например саркома Капоши, неходжкенская лимфома и др.

 Диагностика. В настоящее время наиболее чувствительными и специфичными тестами признаны ИФА и метод вестернблота. ИФА позволяет выявить AT к ВИЧ; при постановке реакции используют Аг, выделяемые из заражённых клеточных культур либо полученные с помощью рекомбинантных ДНК. При положительном результате исследования тест проводят повторно (для избежания возможных ошибок).  Поскольку цель метода — выявление AT, его считают малопригодным для ранней диагностики ВИЧ-инфекции. Время, необходимое для появления AT, выявляемых ИФА, составляет в среднем около 2 мес со дня заражения. По последним данным у 95% инфицированных они появляются лишь через 5-8 мес. Альтернативные подходы к ранней диагностике ВИЧ-инфекции: Выявление факта вирусемии устанавливают в культуре клеток in vitro и с помощью ПЦР.   Выявление антигенемии проводят модифицированной иммуноферментной пробой, обнаруживающей р24-Аг в сыворотке, обработанной кислотой (в результате процедуры разрушаются иммунные комплексы и высвобождаются Аг). На поздних стадиях ВИЧ-инфекции результаты серологических исследований могут быть ложноотрицательными, что обусловлено снижением титров AT и активности образования дочерних популяций возбудителя из-за общего снижения количества чувствительных имму-нокомпетентных клеток. Методы, выявляющие AT, практически неприемлемы для диагностики ВИЧ-инфекции у новорождённых, т.к. материнские IgG могут присутствовать в сыворотке ребёнка до года и более. Альтернативные диагностические подходы включают:  Выделение вируса in vitro и выявление генетического материала возбудителя с помощью ПЦР, результаты бывают положительными у 35-55% инфицированных новорождённых в возрасте менее 1 нед и у 90-100% 3-6-месячных детей. Проба на р24-Аг бывает положительной у 85-95% заражённых детей в возрасте 4-6 мес, значительно реже Аг можно обнаружить у детей младше 4 мес.  Выявление специфического IgA в плазме и моче. Принято считать, что IgA образуется в организме плода, т.к. материнские IgA не способны к трансплацентарному переносу, что связано с низкими титрами сывороточных IgA и неспособностью секреторных молекул проникать в кровоток. У заражённых детей достоверный рост титров AT отмечают после 3 мес жизни. В некоторых случаях положительные результаты у неинфицированных новорождённых обусловлены трансплацентарным транспортом некоторой части материнского IgA. В противоположность этому, плод может in utero реагировать с растворимыми ВИЧ-Аг, проникающими через плаценту. Вестернблот- (иммуноблот-)тест применяют для подтверждения факта ВИЧ-инфекции. Результаты рассматривают как положительные после обнаружения AT к р24, р31, а также к gp41 либо к gp120.

Грибы

Патогенные дрожжевые и дрожжеподобные грибы