Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

                                                                                                                                                     

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАСТЕНИЙ РАН

 

 

На правах рукописи

 

 

 

 

 

МАКАРЕНКО АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

 

БИОСЕНСОРЫ  ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ СУЛЬФОАРОМАТИЧЕСКИХ И ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ

COMAMONAS И PSEUDOMONAS - ДЕСТРУКТОРОВ

п-ТОЛУОЛСУЛЬФОНАТА И ФЕНОЛА

 

 

Специальность: 03.00.23 – биотехнология

 

 

Диссертация

на соискание  ученой степени

кандидата биологических  наук

 

 

 

 

 

 

 

Научный руководитель:

д.х.н., профессор

Решетилов А.Н.

 

 

 

 

 

 

САРАТОВ, 2007 год

 

 

 

Список  используемых сокращений     6

1. ВВЕДЕНИЕ          7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление 

в аналитической  биотехнологии       13

2.1. Типы преобразователей, используемые в 

биосенсорах. Электрохимические преобразователи   14

2.2. Типы биологических материалов, применяемых в

рецепторных элементах  биосенсоров     15

2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и

иммунных комплексов, ДНК, животных и 

растительных  клеток, клеточных органоидов   15

2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток    17

2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых

и водных сред         19

2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы      19

2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы      20

2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью

микробных биосенсоров       21

2.2.2.2.1. Определение БПК        21

2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов    25

2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных 

поверхностно-активных веществ (ПАВ)    28

2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического 

материала в рецепторном элементе сенсора    29

2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование

в разработке биосенсоров для детекции токсичных

соединений           30

2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных  соединений  30

2.3.2. Методы направленной модификации 

микроорганизмов для придания им деструктивных свойств   34

2.3.3. Плазмидная детерминированность  генов биодеградации 35

2.4. Потребности  в детекции ароматических и 

сульфоароматических соединений              36

2.4.1. Ароматические соединений и их  влияние на экосистемы   36

2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических

соединений              36

2.4.3. Возможный механизм биодеградации 

толуолсульфоната (ТС)             37

2.5. Характеристика  штамма Comamonas testosteroni         38

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ             41

3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов

к деградации толуолсульфоната (ТС)            41

3.1.1. Трансформация  ТС свободными клетками           41

3.1.2. Деградация  ТС иммобилизованными клетками           42

3.1.3. Определение  скорости ферментативной реакции  клеток      42

3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях           42

3.1.5. Контроль  процесса деградации             43

3.1.6. Получение  плазмидного и бесплазмидного  варианта 

штамма C. testosteroni               43

3.2. Разработка  микробного сенсора для определения 

п-толуолсульфоната                44

3.2.1. Среда культивирования               44

3.2.2. Иммобилизация  микроорганизмов            44

3.2.3. Исследование  деградирующей активности 

микроорганизмов               44

3.3. Разработка  микробного сенсора для детекции  фенола         45

3.3.1. Объект исследования                      45

3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола             46

3.3.3. Иммобилизация клеток                     46

3.3.4. Хранение беактериальных штаммов           47

3.3.5. Скорость окисления субстрата

бактериальными  клетками             47

3.4. Характеристика  полярографической измерительной 

системы                 48

3.5. Деградация  фенола в колоночном реакторе  с 

иммобилизованным  активным илом установки 

биохимочистки (БХО)               49

3.5.1. Отбор проб активного ила              49

3.5.2. Иммобилизация  активного ила             49

3.5.3. Условия  эксперимента              49

3.5.4. Контроль  на входе и выходе колонки             49

3.5.5. Данные  по работе установки биохимочистки           49

3.5.6. Определение фенола               50

3.6. Оптимизация  работы установки БХО            50

3.6.1. Концентрация  растворенного кислорода           50

3.6.2. Проведение  замеров               50

3.7. Статистическая  обработка полученных результатов        50

3.8. Основные  технические параметры анализатора         50

4. РЕЗУЛЬТАТЫ  И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ            51

4.1. Биодеградация  ТС с помощью 

C.testosteroni BS1310(pBS1010)              52

4.1.1. Деградация  ТС свободными и иммобилизованными 

клетками в  периодических условиях             52

4.1.2. Деградация ТС в  непрерывных условиях           54

4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (ТС)          57

4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов         57

4.2.2. Характеристика  штамма Comamonas testosteroni          57

4.2.3. Характеристика  сенсоров на основе 

плазмидсодержащего  и бесплазмидного штамма C. testosteroni      58

4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток

Comamonas testosteroni в проточной системе            76

4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции

фенола                  80

4.3.1.Скрининг  штаммов-деструкторов фенола            80

4.3.2. Характеристика  штамма 32-I

(Субстратная  специфичность)              84

4.3.3. Характеристика  сенсоров на основе 

плазмидсодержащего  и бесплазмидного вариантов

штамма 32-I                 85

4.4. Возможные пути решения практических задач

с применением  биосенсорного подхода                 97

4.4.1. Деградация  целевых соединений сточных вод 

иммобилизованными на колонке микроорганизмами

установки биохимочистки сточных вод (БХО)                100

4.4.2. Использование полученных данных для оценки

эффективности процесса очистки стоков в аэротенках

установки биохимической  очистки           106

4.4.2.1. Исходное  состояние установки биохимочистки         106

4.4.2.2. Результаты  проведенных технических и 

технологических мероприятий на сооружениях БХО        111

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ              116

6. ВЫВОДЫ                118

7. ЛИТЕРАТУРА               120

8. ПРИЛОЖЕНИЕ               144

8.1. Акт  внедрения               144

 

Список используемых сокращений

 

Вт – ватт

г – грамм

мА – миллиампер

мг – миллиграмм

мин – минута

мкМ – микромоль

мкм – микрометр

мл – миллилитр

мМ – миллимоль

мм – миллиметр

нА – наноампер

нА/с – наноампер  в секунду

нМ – наномоль

нм – нанометр

об/мин – оборотов в  минуту

ОП – оптическая плотность

см – сантиметр

сут - сутки

тпн – тысяч пар нуклеотидов

ТС - толуолсульфонат

ч – час

 

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность  проблемы. В условиях современного интенсивного промышленного производства значительно возросла нагрузка на объекты окружающей среды, что выразилось ее значительным загрязнением токсичными соединениями [1-3]. Фенольные и сульфоароматические соединения, которые широко применяются в химической промышленности и в ряде случаев в значительных количествах попадают в водные экосистемы, относятся к классам поллютантов, наносящих существенный ущерб окружающей среде. Так, в мире, согласно литературным данным, ежегодно производится более 50000 тонн фенолов и пентахлорфенолов, 40000 тонн монохлорфенолов, более 2 млн. тонн сульфонатов. Соответственно, высок и уровень загрязнения окружающей среды в процессе производства. В частности, по Российской Федерации в 1999 году в поверхностные водные источники поступило 60 тонн фенолов; только по Архангельской области в 2002 году сброс фенола в поверхностные водные источники составил 5,5 тонн. Выраженная во всем мире тенденция к уменьшению антропогенного воздействия на окружающую среду приводит к ужесточению требований экологического законодательства. На многих предприятиях, в частности, на нефтеперерабатывающих заводах, принадлежащих корпорации Тюменская Нефтяная Компания & British Petroleum(ТНК-BP), вводятся в действие корпоративные стандарты по охране окружающей среды, соблюдение которых относится к приоритетным направлениям работы корпорации. В связи с этим задача обнаружения токсичных соединений, в частности, фенолов и сульфоароматических, в объектах окружающей среды относится к разряду актуальных. В арсенале аналитических методик обнаружения ксенобиотиков предпочтение отдается простым, надежным и оперативным методам и приборам на их основе. Одним из важных условий является снижение стоимости анализа. Применяемые в настоящее время физико-химические методы (масс-спектрометрия, хроматография, спектральный анализ) достаточно сложны и дорогостоящи [4, 5]. Исследования последних лет показали, что в качестве нового эффективного подхода к определению широкого спектра органических соединений, в том числе – токсичных, в образцах окружающей среды может быть использован метод биосенсорной детекции [6-9]. В этой связи интенсивно разрабатываются новые виды биосенсоров для решения задач экологического контроля. Важная роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала. Уникальной характеристикой микроорганизмов является их способность окислять широкий спектр органических соединений. Это дает возможность относительно простыми способами, используя принцип регистрации клеточного дыхания, формировать Биосенсоры для детекции различных органических соединений. Вместе с тем, несмотря на актуальность задачи обнаружения фенолов и сульфоароматических соединений, до настоящего времени не были описаны Биосенсоры микробного или другого типов для анализа п-толуолсульфоната, и имеется незначительное число публикаций, посвященных разработке ферментных и микробных биосенсоров для детекции фенола и его производных. Существующее положение в данной области и общая актуальность задачи определили постановку цели и задач исследования.

Цель  исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната и фенола, соответственно.

Были  поставлены следующие задачи:

1. На основании  имеющихся литературных данных  произвести выбор штаммов, обладающих  характеристиками, требуемыми для  формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала.

2. Оценить характеристики процесса деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработать лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров.

3. Выполнить  сравнительную оценку характеристик  биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas.

4. Используя  активный ил водоочистных сооружений  в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса очистки промышленных стоков от фенола. На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства.

Научная новизна работы. На основании имеющихся литературных данных произведен выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола, и экспериментально показано, что эффективным типом преобразователя является кислородный электрохимический электрод для регистрации содержания кислорода в среде. Оценены характеристики процесса деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработаны лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Выполнена сравнительная оценка характеристик биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas. Показано, что сенсоры, основанные на плазмидсодержащих бактериях, обладают высокой селективностью в отношении целевых соединений, которая резко снижается при использовании бесплазмидных штаммов. Полученные сравнительные оценки субстратной специфичности плазмидного и бесплазмдного штаммов носят характер фундаментальных результатов и могут быть эффективно использованы для развития научных основ и практического применения биосенсоров.