Основные направления современной гистологии, их методы исследования

                                                    ОГЛАВЛЕНИЕ 

Введение                                                                                                              4

Глава 1. Методы микроскопирования гистологических препаратов            5

        1.1. Световая микроскопия                                                                      5

          1.1.1 Ультрафиолетовая микроскопия                                                    5

          1.1.2 Люминесцентная, или флуоресцентная, микроскопия                6

          1.1.3 Фазово-контрастная микроскопия                                                 6

          1.1.4 Микроскопирование в темном поле                                               7

          1.1.5 Интерференционная микроскопия                                                 7

          1.2 Поляризационная микроскопия                                                         8

          1.2.1 Электронное микроскопирование                                                  8

         1.2.1.1 Метод замораживания – скалывания                                          8

          1.2.1.2 Метод криоэлектронной микроскопии                                       9

          1.2.1.3 Метод «замораживание-травление»                                            9

          1.2.2 Метод сверхвысокой микроскопии                                                9

          1.2.2.1 Рентгеноструктурный анализ                                                      10

          1.2.3 Методы контрастирования солями тяжелых металлов               10

Глава 2. Методы исследования фиксированных клеток и тканей. Гистологические красители                                                                              11

Глава 3. Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей                                                                                                                   20

           3.1 Гисто - и иммуноцитохимические методы                                      20

           3.2 Методы иммунофлюоресцентного анализа.

           Применение антител                                                                                20

           3.3 Метод радиоавтографии                                                                    21

Глава 4. Методы качественного и количественного химического анализа гистологических структур                                                                                 23

          4.1 Цитоспектрофотометрия                                                                   23

          4.2 Дифференциальное центрифугирование                                         23                

          4.3 Цитоспектрофлюориметрия                                                              23

          4.4 Интерферометрия                                                                               24

          4.5 Автоматизированные системы обработки  изображений                24   Заключение                                                                                                          25

Список  литературы                                                                                             26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ

      Гистология (от греч. histos — ткань, logos — учение) — наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов.

      В гистологии имеется несколько разделов, изучающих определенные уровни организации живой материи, начиная с клеточного и заканчивая органным и системным уровнями, составляющим организм.

      Гистология относится к морфологическим наукам. В отличие от анатомии, изучающей строение органов на макроскопическом уровне, гистология изучает строение органов и тканей на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом подход к изучению различных элементов производится с учетом выполняемой ими функции. Такой метод изучения структур живой материи называется гистофизиологическим, и гистология нередко именуется гистофизиологией.                                 При изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматриваются не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методами цито- и гистохимии определяется химический состав веществ, образующих данные структуры. Изучаемые структуры также рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном периоде, так и на протяжении начального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения в гистологию эмбриологии.

      Задачей гистологии как науки является выяснение закономерностей строения различных тканей и органов для понимания протекающих в них физиологических процессов и возможности управления этими процессами.

      Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов. 

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

      Микроскопия может быть световая (с использованием светового микроскопа) и электронная (с использованием электронного микроскопа). Световая микроскопия может осуществляться в проходящем свете, когда свет проходит через тонкий прозрачный гистологический препарат, или же в отраженном свете, когда исследуют, например, толстый или непрозрачный объект. Аналогичным образом, электронная микроскопия может быть трансмиссионной, когда пучок электронов проходит сквозь изучаемый ультратонкий срез, или же растровой, или сканирующей, когда пучок электронов отражается от поверхности исследуемого объекта. В первом случае электронный микроскоп называется трансмиссионным (ТЭМ), а во втором – сканирующим (СЭМ). 

1.1 СВЕТОВАЯ  МИКРОСКОПИЯ 

      Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др. 

1.1.1 УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ 

      Метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура — электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.

      В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь). 

1.1.2 ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ, ИЛИ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ, МИКРОСКОПИЯ 

      Метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином) (рис.1). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК — оранжевое.

      Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем. 

Рис.1 Флюорохромы 

1.1.3 ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ 

      Метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.    

      Служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для изучения препаратов в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структур достигается с помощью окрашивания. Метод фазового контраста обеспечивает необходимую контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе (рис.2). Такая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления.

      Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение. 

 

Рис.2 Устройство для наблюдения методом фазового контраста КФ-4 

1.1.4 МИКРОСКОПИРОВАНИЕ  В ТЕМНОМ ПОЛЕ 

      В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Разрешение этого микроскопа не может быть лучше, чем у светлопольного микроскопа, так как используется такая же длина волны. Но здесь достигается больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, авторадиографических объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности treponema pallidum, вызывающей сифилис и др. 

1.1.5. ИНТЕРФЕРЕНЦИОННАЯ  МИКРОСКОПИЯ 

     Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для

количественного определения массы ткани, и дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

     В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

      Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.