Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

 Недавно выделенный в отдельную нозологическую форму стрептококковый синдром токсического шока обычно развивается как осложнение целлюлитов, фасцитов и бактериемии; клинические проявления аналогичны таковым при септических шоках, а смертность может достигать 30%.

Лабораторная диагностика. «Золотым стандартом» считают выделение возбудителя, т.к. прочие методы диагностики имеют различные ограничения. Через 24 ч на кровяном агаре стрептококки группы А образуют колонии 3 типов: крупные, блестящие, вязкие, напоминающие каплю воды (характерны для свежевыделенных вирулентных изолятов, имеющих капсулу; наиболее часто образует S. pyogenes); серые, матовые, зернистые, с неровным краем (характерны для свежевыделенных вирулентных изолятов, имеющих М-Аг); выпуклые прозрачные колонии диаметром около 0,1-0,3 мм (характерны для авирулентных лабораторных штаммов), Колонии окружены зоной полного гемолиза (её размеры в 2-4 раза превышают диаметр колонии). На жидких средах дают придонный, иногда поднимающийся вверх рост. В мазках выявляют типичные грамположительные кокки, образующие короткие цепочки; также можно обнаружить полиморфные формы, напоминающие коринебактерии или лактобациллы, либо грамотрицательные формы (из старых культур или от лиц, получавших антибиотики); также следует помнить о способности стрептококков образовывать L-формы. Для дифференцировки выделенные микроорганизмы засевают на тиогликолевую среду, полужидкий агар; выросшие стрептококки отличаются типичной морфологией. Также можно произвести посев на кровяной агар и нанести на его поверхность диск, пропитанный пенициллином (10 ЕД); через 24 ч исследуют мазки из колоний (стрептококки принимают сферическую форму, а лактобациллы сохраняют вытянутую форму). Более 99% изолятов чувствительно к бацитрацину и гидролизуют пирролидонил-р-нафтиламид (ПИР-тест). Стрептококки группы А также можно легко выявить в мазках из зева, используя коммерческие наборы; групповой А-Аг экстрагируют химическими реагентами или ферментами и идентифицируют в реакциях латекс-агглютинации, коагглютинации или ИФА.

Для экспресс-диагностики  ревматической лихорадки и гломерулонефрита можно определять AT к стрептолизину О или стрептодорназе; серологические исследования также позволяют выявлять носителей. Следует помнить, что AT к стрептолизину О не образуются при кожных инфекциях, вызываемых стрептококками группы А.

Стрептококки группы В колонизируют носоглотку, ЖКТ и влагалище; значительная часть изолятов идентифицирована как S. agalactiae. Несмотря на то, что микроорганизм выделяют из влагалища 25-45% беременных женщин, его основным резервуаром считают ЖКТ. Серологически стрептококки группы В разделяют на серовары la, Ib, Ic, II и III; бактерии сероваров 1а и III тропны к тканям ЦНС и дыхательных путей и наиболее часто вызывают менингиты у новорождённых. Вертикальный путь заражения — прохождение плода по родовым путям, инфицированным стрептококками.

 Род Aerococcus

 образуют неподвижные шаровидные клетки диаметром 1,0-2,0 мкм; в мазках из культур, выращенных на жидких средах, располагаются тетрадами. Факультативные анаэробы, но лучше растут в микроаэрофильных условиях. Образуют Н₂0₂, вызывая позеленение кровяного агара. Хемоорганотрофы с окислительным метаболизмом; углеводы ферментируют с образованием кислоты. Каталаза-отрицательны или слабоположительны. Желатин не разжижают; нитраты не восстанавливают. Температурный оптимум 30 °С (также растут при 10 °С, но не при 45 °С). Типовой вид — A. viridans. Сапрофиты, широко распространённые в стационарах; иногда могут загрязнять оборудование для инвазивных исследований. Контаминирование медицинского оборудования способно приводить к эндокардитам и инфекциям мочевыводящих путей. Принципы выделения аэрококков аналогичны таковым при индикации стрептококковых инфекций; бактерии образуют беловато-серые колонии, сформированные крупными кокками, собранными в тетрады или пары. Подобно энтерококкам, они способны расти на средах, содержащих 6,5% NaCl, но не растут при 10 ⁰С, а также чувствительны к бацитрацину.

Семейство Bacillaceae

Сюда относят  бактерии рода Bacillus; представлены преимущественно палочковидными и подвижными хемогетеротрофными клетками. Образуют эндоспоры, характеризующиеся повышенным коэффициентом светопреломления, устойчивостью к повреждающим агентам и высоким содержанием дипиколиновой кислоты (5-20% сухой массы). Род включает 48 видов больших (1,2-7,7x0,3-2,2 мкм), прямых или почти прямых палочек; некоторые виды — строгие аэробы, другие — факультативные анаэробы. Югетка-спорангий образует одну эндоспору. Возможно изменение окрашивания по Грому, но на ранних стадиях роста бактерии грамположительны. Хемогетеротрофы, метаболизм строго дыхательный или дыхательный и бродильный одновременно (редко строго бродильный); большинство видов образуют каталазу. Род Bacillus содержит несколько патогенных для человека видов; типовой вид — Bacillus subtilis. За счёт высокой термо-и химиорезистентности спор считаются одними из основных микроорганизмов, контаминирующих медицинское оборудование и препараты (например, консервированные препараты крови).

Bacillus anthracis

возбудитель сибирской язвы у человека и животных. Заболевание известно с глубокой древности, со времён Гиппократа и Гомера, Галён и Цёльса  болезнь фигурирует под названием «священный огонь» (ignis sacer) или «персидский огонь» (ignis persicus). С.С. Андриевский, изучавший заболевание во время эпидемии на Урале (1786-1788), дал ему название «сибирская язва», а в 1788г. путём самозаражения доказал единство этиологии сибирской язвы у людей и животных. Возбудитель впервые описали Поллёндер, Брауэлл (1849) и Давэн (1850). Чистую культуру возбудителя получил Кох (1876), а в 1881 г. Пастёр предложил живую вакцину для иммунопрофилактики заболевания. В связи с монополизацией её производства Пастеровским обществом, Л.С. Ценковский независимо создал отечественную живую вакцину. В 1902г. Асколи разработал диагностическую реакцию преципитации, широко используемую на практике.

Морфология возбудителя. Крупная толстая палочка (5-10x1-2 мкм) с закруглёнными концами (при образовании цепочек — с обрезанными под прямым углом концами); неподвижна (абсолютный дифференциально-диагностический признак); легко окрашивается по Граму (грамположительна) и анилиновыми красителями. В клиническом материале располагается парами или в виде коротких цепочек, окружённых общей капсулой; на питательных средах образует более длинные цепочки; при этом морфология палочек несколько изменяется — они слегка утолщены на концах и образуют сочленения («бамбуковая трость»). Подобные морфологические изменения ещё более явно проявляются при температурной фиксации для окрашивания по Граму. Обработка культур пенициллином приводит к разрушению клеточных стенок и образованию цепочек, состоящих из протопластов («жемчужное ожерелье»). Для защиты от факторов резистентное (фагоцитов, AT) образуют капсулы, наблюдаемые только у бактерий, обитающих в живых организмах либо на средах, содержащих нативную сыворотку (например, среда ГКИ). Капсулы более устойчивы к действию гнилостной микрофлоры, чем микробные тела, и в материале из разложившихся трупов нередко можно обнаружить лишь пустые капсулы («тени» микробов). Для более быстрого обнаружения капсул можно окрасить мазки полихромным метиленовым синим Лёффлера (клетки синие, капсулы красно-малиновые). Образуют центрально расположенные эндоспоры, для чего необходимы кислород и определённая температура (12-42 °С); в живом организме спор не образуют; также не образуют спор в невскрытых трупах, что опосредовано поглощением свободного кислорода в процессе гниения. Споры отличает высокая устойчивость к внешним воздействиям; в воде сохраняются до 100 лет, в почве — до 30лет.

Культуральные свойства. Bacillus anthracis хорошо растёт на обычных питательных средах; бактерии можно даже выращивать на сыром или варёном картофеле, настое соломы, экстрактах злаков и бобовых. Температурный оптимум на агаре 35-36 ⁰С, на бульоне 32-33 ⁰С; оптимум рН 7,0. На жидких средах растёт в виде ватных хлопьев, взвешенных комком, не вызывает помутнения среды. Даёт характерный рост при посеве уколом в желатин («перевёрнутая ёлочка»); позднее верхний слой желатина разжижается, образуя воронку. На твёрдых средах образует крупные шероховатые серовато-белые колонии (R-формы) диаметром 2-3 мм, типичными считают характерные волокнистые колонии («голова Медузы» или «львиная грива»), образованные переплетающимися цепочками бактерий. Рост вирулентных штаммов на плотных средах и желатине настолько характерен, что может служить диагностическим признаком. На свернувшейся (30 мин при 80 °С) лошадиной сыворотке растёт в виде гладких прозрачных S-колоний, тянущихся за петлёй.

Потребность в кислороде. Палочка сибирской язвы — аэроб или факультативный анаэроб; в анаэробных условиях (либо при значительном варьировании температурного режима) образует мелкие единичные колонии. При культивировании в микроаэрофильных условиях всегда образует гладкие (S), слизистые (М) или смешанные (SM) колонии.

Спорообразование. Споры Bacillus anthracis овальной формы размером 0,8-1,Ох 1,5 мкм; сильно преломляют свет. Они очень легко образуются на бедных питательных средах, а при свободном доступе кислорода — даже в дистилляте или нефиксированных мазках (последнее следует иметь в виду при работе с вирулентными штаммами). На плотных средах спорообразование идёт быстрее, чем на жидких; через 32-48 ч при 37 ⁰С оно бывает практически полным. Прекращается полностью при 15 °С и 42-43 ⁰С. Скорость прорастания зависит от температуры (оптимум 37 °С) и возраста спор; молодые споры в оптимальных условиях прорастают за 1-1,5 ч, старые — за 2-10 ч.

Биохимия. Возбудитель образует кислоту без газа на средах с глюкозой, фруктозой, мальтозой и декстрином. Слабое или отсроченное образование газа наблюдают на средах с глицерином и салицином (не у всех штаммов). Кислотообразования не находят на средах с арабинозой, рамнозой, маннозой, галактозой, раффинозой, лактозой, инсулином, маннитом, дульцитом, сорбитом и инозитом. Гидролизует крахмал; образует ацетилметилкарбинол и лецитиназу. Bacillus anthracis очень медленно и слабо коагулирует жидкую желточную среду; нередко изоляты вообще лишены такой способности. Положительный результат можно ожидать не ранее 5-7 сут инкубирования при 37 ⁰С; в то же время сапрофитные бациллы разлагают её за 6-10 ч. В отличие от сапрофитов, палочки сибирской язвы лишены фосфатазы и не разлагают фосфаты, содержащиеся в питательной среде. Молоко свёртывают за 3-5 сут; затем сгусток медленно пептонизируется и разжижается; выделяется аммиак и (в связи с окислением тирозина) накапливается бурый пигмент.

Клинические проявления для КВД. заболевания у человека зависят от пути заражения Bacillus anthracis. Инкубационный период составляет 2-6 сут. При всех формах болезни возможно развитие диссеминированной инфекции с бактериемией и менингитом, приводящей к смерти больного.

Кожная  форма. Кожа открытых частей тела поражается чаще, чем закрытых одеждой; бритьё создаёт оптимальные условия для заражения (участки, подвергающиеся бритью, поражаются в 2 раза чаще); участки кожи с обильной жировой смазкой (например, кожа носа) не поражаются; также не поражаются кончики пальцев и ногтевые ложа. Наиболее часто очаги локализованы на верхних конечностях, голове, шее. В месте входных ворот инфекции сначала появляется красноватое пятно, быстро трансформирующееся в папулу медно-красного цвета. С самого начала больные отмечают кожный зуд, усиливающийся в динамике заболевания. Через несколько часов на месте папулы образуется везикула диаметром 2-3 мм; её содержимое сначала имеет серозный характер, затем становится тёмным, кровянистым (pustula maligna); из-за сильного зуда больные часто срывают везикулу, либо она лопается сама, и на её месте образуется струп, быстро чернеющий или увеличивающийся в размерах. Характерно формирование дочерних пустул, проходящих все этапы развития и сливающихся в один коричнево-чёрный струп с твёрдой, как бы обгорелой коркой, что определило более известное название болезни — углевик (от грен, anthrax — уголь). Струп окружает инфильтрат в виде багрового вала; как правило, дополнительно присоединяется отёк, охватывающий большие участки. При ударах перкуссионным молоточком в области отёка часто наблюдают студневидное дрожание (признак Стефановского); некоторые авторы рекомендуют рассматривать его как диагностический признак.

Лабораторная диагностика в определённой степени зависит от клинической формы заболевания. Для исследования берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбункула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные боксы или деревянные ящики. Анализы предусматривают не только проведение рутинных бактериологических исследований, но и заражение лабораторных животных для окончательного уточнения диагноза. Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме с посевом на обычные питательные среды, определением подвижности, окраской по Граму и изучением биохимических особенностей .

Серологические исследования позволяют идентифицировать инфекцию у больных и реконвалесцентов; возбудитель можно выявлять AT, меченными флюоресцеинами (особенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РИГА и ИФА. Кожные пробы (реакция ГЗТ) проводят внутрикожным введением 0,1 мл бактериального аллергена (антраксин); применяют для ретроспективной диагностики при эпидемиологических исследованиях. Реакция Асколи имеет большое значение, т.к. позволяет идентифицировать возбудитель при отрицательных результатах бактериологических исследований. Однако для прижизненной диагностики она не имеет серьёзных преимуществ перед вышеуказанными бактериологическими и серологическими методами. Лизабельность бактериофагом. Возможно проведение дифференциальной диагностики с помощью бактериофагов «ВА-9» и «Саратов». Отличительная особенность возбудителя — высокая чувствительность к пенициллину; выращивание на средах, содержащих пенициллин, приводит к проявлению феномена «жемчужного ожерелья». Биологическая проба. Заражение подопытных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 сут, морские свинки и кролики — через 2-4 сут. Наблюдение продолжают в течение 10 дней. У павших животных обычно исследуют печень, селезёнку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца, места введения заразного материала. Делают посевы на питательные среды.

Pод Erysipelothrix

Прямые или изогнутые палочковидные бактерии (0,8-2,5x0,2-0,4 мкм), имеющими тенденцию образовывать длинные нити длиной до 60 мкм; последние могут утолщаться и содержать гранулы. Неподвижны, спор и капсул не образуют; хемоорганотрофы; грамположительны, но в старых культурах могут изменять отношение к окраске по Граму. Факультативные анаэробы; каталаза-отрицатель-ны; ферментативная активность слабая — ферментируют глюкозу и некоторые углеводы с образованием кислоты; на кровяных средах дают α-гемолиз. Широко распространены в природе, паразиты рыб и теплокровных; типовой вид — Erysipelothrix rhusiopathiae, Такахаши с соавторами описали второй вид — Е. tonsillarum (1987), отличающийся от первого лишь степенью гомологии ДНК.