Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Морфология. Т. pallidum подвид pallidum имеет спиралевидную форму с одинаковыми по высоте завитками, которых может быть до 14; средние размеры 6-14x0,2-0,3 мкм, но в культурах размеры могут быть значительно большими; движения разнообразные -от винтообразных до сгибательных. Доказана способность образовывать L-формы (С.М. Вя-селева, Л.М. Устименко). Основной способ размножения — поперечное деление, хотя многие авторы предполагают более сложный цикл. Трепонема малоустойчива во внешней среде (гибнет при высыхании), но на холоде в матерчатых тканях может сохраняться до 50 сут. Прогревание при температуре 40 °С в течение часа приводит к утере патогенных свойств, при 48 ⁰С гибнет за 10 мин. Возбудитель сохраняется в течение 3-6 сут при 25 °С в жидкой среде, содержащей редуцирующие агенты, а также в течение 24 ч в крови при температуре 4 ⁰С.

Культуральные свойства. Факультативный анаэроб; чрезвычайно прихотлива и практически не растёт на искусственных средах. Тем не менее первая культура была получена Я.Г. Шерешевским (1909) на полусвернувшейся лошадиной сыворотке. Могучи использовал посев в глубину асцитического агара; наибольшее количество штаммов в нашей стране выделили В.М. Аристовский и P.P. Гельцер: эти «казанские штаммы» наряду со штаммом Райтера применяют для изготовления Аг для серодиагностики. Длительное культивирование на искусственных средах вызывает адаптацию к более простым средам (например. Китта—Тароцци) и потерю патогенных свойств. Для выращивания бледных трепонем обычно используют МПБ или печёночный бульон с добавлением кусочков печени и яичек кролика. Также можно применять бульон из бычьего сердца с тиогликолятом Na или МПБ, дополненный кроличьей, лошадиной сывороткой или сывороткой человека либо асцитической жидкостью. Посевы культивируют в относительно анаэробных условиях при температуре 35 "С. Неплохие результаты можно получить, используя метод культивирования по Могучи. Мелкие колонии появляются на 3-5 сут культивирования. На среде 199, дополненной печёночным бульоном и кроличьей сывороткой, оптимальный рост можно наблюдать на 7-9 день.

Биохимические свойства изучены мало. Некоторые штаммы (казанские штаммы I, IV, штамм Рюйтера, ставропольские штаммы VI, VII, VIII и IX) образуют индол и H,S, а казанские штаммы II и V этими свойствами не обладают. Некоторые разжижают желатин; штамм VIII разлагает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и маннит с образованием кислоты, а штамм IX разлагает лишь глюкозу; единичные штаммы гемолизируют эритроциты человека.

Эпидемиология. Заболевание регистрируют повсеместно, особенно в развивающихся странах. В XX в. рост заболеваемости отмечали в 30-40-х гг., затем последовал её спад. С 1986 г. отмечают повсеместное увеличение количества заболевших, а в некоторых регионах (включая и некоторые в РФ) оно достигает почти эпидемических величин. Резервуар инфекции — больной человек. Возбудитель передаётся в большинстве случаев при половых контактах (реже — контактным путём, например, при поцелуях). Наибольшую опасность представляют лица на ранних этапах болезни, в III и IV стадиях они практически теряют инфекционность (в среднем через 4 года после заражения). Возможна передача возбудителя от матери плоду трансплацентарно или при прохождении по родовым путям. Следует отметить, что возбудитель не способен проникать через плаценту в первые 4 мес беременности, и лечение матери на этих сроках препятствует инфицированию плода.

Клинические проявления. Следует помнить, что разделение сифилиса на стадии носит условный характер, т.к. последовательность их смены наблюдают далеко не во всех случаях. Инкубационный период варьирует по продолжительности от 10-11 до 90 сут (в среднем — 21-24 дня); с момента появления первичного аффекта (твёрдый шанкр или сифилома) начинается первая стадия болезни (рис. 18-5). Через 7-10 сут возникают регионарный лимфаденит, переходящий (на 5-6 нед) в полиаденит (в этот период развивается генерализованная спирохетемия). Постепенно первичное поражение рубцуется. Следует помнить, что в первые 3 нед реакция фон Вассерманна отрицательна (первичный серонегативный сифилис), a AT появляются с 4 нед (первичный серополо-жительный сифилис). При отсутствии надлежащего лечения через 6-7 нед после появления твёрдого шанкра развивается вторая стадия болезни. Характерный симптом — рецидивирующие пятнистые, папулёзно-розеолёзные и пустулёзные высыпания (сифилиды) на коже (вторичный «свежий» сифилис); они розовато-красного цвета, размеры варьируют от величины чечевичного зерна (розеолы) до монеты (папулы); при тяжёлых формах (у алкоголиков, наркоманов) пустулы могут образовывать изъязвления значительных размеров (сифилитические рупии). Периодическое исчезновение высыпаний (латентный период) обусловлено развитием иммунных реакций, направленных на уничтожение возбудителя. Однако часть трепонем сохраняется в лимфатических узлах и внутренних органах. На фоне различных стрессов, интоксикаций и острых инфекций наблюдают ослабление активности защитных реакций, и высыпания появляются вновь (хотя и в меньших количествах), т.е. развивается вторичный рецидивирующий сифилис. На протяжении второй стадии возможно несколько рецидивов. Патогенетически вторая стадия — фаза генерализованной спирохетемии с поражением внутренних органов и нервной системы. Прогноз поражений более тяжёлый, излечиваются не более 25% больных, у 25% процесс переходит в латентную фазу, а у 50% заболевание трансформируется в третью стадию.

Третья стадия развивается при отсутствии лечения (обычно через 3-4 г.). Характерно образование многочисленных гранулём в кожных покровах либо в различных органах, костях и нервных тканях (гуммы). Гранулёмы склонны к распаду и рубцеванию, что может вызывать серьёзные нарушения функций внутренних органов (висцеральный сифилис). Гуммы содержат незначительное количество трепонем, но исключить инфек-ционность больных третичным сифилисом нельзя, особенно при локализации гранулём в полости рта или на половых органах. При проведении неадекватного лечения заболевание не заканчивается третичной стадией, и у части больных (в среднем через 8-15 лет) может развиться нейросифилис — тяжёлое поражение ЦНС (сифилис мозга, спинная сухотка или прогрессирующий паралич). Основные отклонения от типичной клинической картины — сифилис без шанкра и злокачественный сифилис. Первый обусловлен непосредственным проникновением трепонем в кровоток (при внутривенных вливаниях), проявления наступают через 2-3 мес в форме вторичного сифилиса. Злокачественную форму наблюдают только у ослабленных и истощённых больных (хотя именно она доминировала во время пандемии XV-XVI веков в Европе); характерны высыпания в форме сифилитических рупий и обширные поражения костей, лимфаденопатия и серологические реакции выражены слабо. Исследования последних десятилетий показывают, что больные сифилисом не обязательно проходят через весь спектр его клинических проявлений. Считают, что приблизительно у 1/3 больных третичным сифилисом развивается нейросифилис, у 1/3 — гуммы, а у остальных — сердечно-сосудистые заболевания. Однако обследование пациентов в различных странах показало несоответствие действительности данным положениям, например, в Эфиопии третичный сифилис регистрируют только в форме сердечно-сосудистых поражений. Таким образом, можно полагать, что клинические проявления сифилиса прямо зависят от характера иммунологического реагирования пациента, способного останавливать развитие поражений на любой стадии, а также от соотношения гуморальных и клеточных реакций гиперчувствительности.

Врождённый сифилис развивается при инфицировании плода от больной матери (возбудитель проникает по пупочной вене или лимфатическим щелям пупочных сосудов); у больных женщин часто наблюдают выкидыши во второй половине беременности либо мертворождения. В случае рождения жизнеспособного ребёнка клинические проявления можно наблюдать сразу после рождения (ранний врождённый сифилис) либо в возрасте от 5 до 15 лет (поздний врождённый сифилис). Для ранней формы характерны папулёзно-розеолёзные высыпания, сифилитическая пузырчатка, остеохондриты, поражения внутренних органов (печень, селезёнка) и нервной системы (менингиты, менингоэнцефалиты). Типичное проявление поздней формы — триада Хатчинсона — паренхиматозный кератит, «бочкообразные зубы» и глухота (вследствие поражения лабиринта); нередко наблюдают изменения большеберцовых костей («саблевидные голени»).

Лабораторная диагностика включает выявление возбудителя (в начальной стадии) и постановку серологических реакций. Выделение возбудителя обычно не проводят, т.к. доступные методы получения культур не разработаны. Выявление возбудителя проводят микроскопией материала, полученного от больного. Перед тестированием не следует проводить химиотерапию и местное лечение. При исследовании шанкра необходимо брать отделяемое язвы из глубины (где меньше контаминирующей микрофлоры); для этого поражение освобождают от гнойных масс и энергично массируют (сдавливают) со стороны прилежащих тканей до получения прозрачного отделяемого; при небольшом количестве отделяемого его можно внести в каплю физиологического раствора. При невозможности получения материала из шанкра проводят пункцию регионарных лимфатических узлов. Наиболее оптимальный метод выявления — темнопольная микроскопия (предложена Ландшташером в 1906 г.); не следует путать Т. paltidum подвид pallidum с нитями фибрина, а также с сапрофитической Т. refringens (колонизирует наружные половые органы и отличается выраженной подвижностью и отсутствием сгибательных движений) и Т. denticola (колонизирует ротовую полость, её завитки короче и направлены под более острым углом). Также следует учитывать возможность вторичного инфицирования трепонемами, вызывающими поражения в странах с жарким климатом. Обычными методами трепонемы практически не окрашиваются (отсюда «бледная трепонема»), т.к. при фиксации спиртом оболочка легко разрушается, и клетка не в состоянии удерживать красители; поэтому мазки фиксируют высушиванием (2-3 ч) с дополнительной фиксацией в 4% растворе формалина (в течение нескольких минут). Более оптимален метод серебрения по Фонтану и Трибондо, Левадити или Морозову (наиболее распространён в отечественной практике); Т. pallidum подвид pallidum выглядит чёрной или тёмно-коричневой. Достаточно часто применяют окраску по Романовскому-Гимзе, но время окраски удваивают; Т. pallidum подвид pallidum окрашивается в розовый цвет, а непатогенные виды — в фиолетовый или синий. В отличие от бледной трепонемы, Т. refringens хорошо прокрашивается фуксином в красный цвет. Из отрицательных методов хорошие результаты даёт окраска по Бурри с использованием опалового синего вместо туши.

 Серологические исследования — доминирующие методы лабораторной диагностики; включают неспецифические и специфические тесты. Неспецифические тесты (без участия трепонем) Основной из них — РСК с несколькими Аг, предложенная фон Вассерманном; также разработаны более чувствительные модификации, например Григорьева-Рапопорта или Ва'йнштёна-Рёзниковой, но они менее специфичны. Для предварительных исследований также широко используется VDRL-реакция - специализированная флоккуляционная проба на предметных стёклах с использованием кардиолипин-лецитин-холестеринового Аг — модификация реакции Кана и цито-холевой реакции. В качестве метода экспресс-диагностики удобен тест на реагины плазмы, представляющий собой РА частиц угля, нагруженных кардиолипином. Специфические тесты Большое значение имеют реакция Нельсона-Мёиера включающая инкубирование возбудителя с сывороткой пациента в анаэробных условиях, после чего бактерии теряют подвижность (в среднем через 18 ч), также известная как реакция иммобилизации бледной трепонемы (РИБТ) и РА (микроагглютинации) Т. pallidum подвид pallidum. В последние 10-20 лет всё большее распространение получают методы иммуно-флюоресцентной диагностики сифилиса (особенно непрямой иммунофлюорес-ценции), постановка которых отличается простотой, доступностью и 100% чувствительностью. Наибольшее распространение получила реакция иммунофлюорес-ценции с адсорбированной сывороткой, включающая предварительное истощение сыворотки пациента инкубацией с Аг штамма Райтера (что приводит к элиминации перекрёстно реагирующих AT), последующее инкубирование с Аг Т. pallidum подвид pallidum (штамм Николя) в течение 30 мин при температуре 37 ⁰С и внесение антисыворотки к Ig, меченной флюоресцеином.

Т. pallidum подвид pertenue.

 Возбудитель хронического генерализованного спирохетоза, известного как тропическая гранулёма или фрамбезия. Заболевание было известно в Африке ещё с добиблейских времён. Более широкое распространение, особенно в Новом Свете, получило в XVI-XVII вв. в период развития работорговли. Возбудитель впервые выделен Кастемани (1905) вскоре после открытия возбудителя сифилиса. Микроорганизм неспособен вызывать поражения у лабораторных животных, крайне неустойчив во внешней среде (при температуре 25-28 °С погибает в течение 2-5 ч), в сыворотке человека вирулентность утрачивает через 4 ч при 37 ⁰С.

Морфология возбудителя, отношение к красителям, а также морфология культур сходны с бледной трепонемой; средние размеры 7-20x0,2 мкм.

Эпидемиология. Заболевание наблюдают в виде эндемичных очагов во всех тропических регионах, особенно в Экваториальной Африке, Южной Америке, Южной Азии и островах Океании. Основной путь передачи — контактный (очень редко половой), через повреждения кожных покровов; определённая роль в механической передаче может принадлежать мухам, в кишечнике которых возбудитель выживает до 7 ч. Наиболее подвержены дети и подростки, особенно страдающие экземами и дерматитами. В 50-е гг. число инфицированных достигало 50-100 млн, но после широкомасштабной лечебно-профилактической кампании к середине 70-х гг. их количество снизилось до 2 млн.

Клинические проявления. Инкубационный период продолжается 2-4 нед; характеризуется спирохетемией с заносом в различные ткани (в том числе в кожу) и развитием первичного поражения — крупной бляшки (фрамбезибма), обычно на конечностях. Её появление сопровождается лихорадкой, недомоганием, головной болью и артралгиями. Первичные поражения могут быть папулёзными, узловатыми или пустулёзными с более или менее выраженным зудом, сливающимися в один очаг, напоминающий ягоду малины. В дальнейшем очаг подвергается распаду, и образуется язва с зернистым дном и резко очерченными краями; в экссудате можно обнаружить Т. pertenue. Через 1-3 мес развивается вторичная стадия, характеризующаяся появлением многочисленных полиморфных высыпаний, окаймлённых зонами гиперемии (фрамбезиды). Через несколько недель часть папул исчезает, а часть трансформируется в гуммоподоб-ные узлы размером до 1 см, подвергающиеся распаду. У 20% больных наблюдают периоститы, у других — сливные поражения вокруг рта или анального отверстия. Продолжительность второй стадии 3-6 мес у детей и 6-12 мес у взрослых. При отсутствии адекватного лечения через некоторое время развивается третичная стадия, характеризующаяся образованием язвенно-гуммозных поражений костей и тяжёлыми деструктивными нарушениями, симулирующими третичный сифилис. Однако они достаточно немногочисленны и не содержат возбудитель. Среди костных изменений упоминания заслуживают экзостозы носа (гунду), чаще наблюдаемые у детей в виде опухолевидных разрастаний; деформирующие ринофарингиты (гангоза) и прогрессирующая язвенно-гранулематозная деструкция твёрдого нёба. Прогноз заболевания благоприятный, хотя у некоторых лиц процесс затягивается до 30 лет. После перенесённого заболевания развивается стойкий иммунитет к повторным заражениям.

Лабораторная диагностика достаточно своеобразна, т.к. клиническая картина очень напоминает проявления сифилиса; более того, у 80-100% пациентов можно выявить положительную реакцию фон Вассерманна, а также и другие реакции на сифилис (например, иммобилизации трепонем). В отличие от Т. pallidum подвид pallidum, T. pallidum подвид pertenue исчезают из периферических лимфатических узлов немедленно после заживления фрамбезиомы. Возбудитель можно обнаружить в экссудате, регионарных лимфатических узлах, в биоптатах очагов поражения; в свежих папулах Т. pallidum подвид pertenue находят в 80-100% случаев. Однако темнопольная микроскопия, серебрение препаратов и прочие методы окраски не позволяют отдифференцировать возбудитель от бледной трепонемы. В большинстве случаев диагноз устанавливают по характерным клиническим проявлениям и более частому поражению детей (редко после 35 лет).

Т. pallidum подвид endemicum (T. bejel).

 Возбудитель хронического генерализованного спи-рохетоза, известного как беджёль или эндемичный сифилис. До настоящего времени ряд авторов считают его возбудителем Т. pallidum подвид pallidum. Впервые заболевание описано Хадсоном в 1928 г.