Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Культуральные свойства. Растёт на простых средах, дополненных 4-5% глицерина; растёт в интервале 20-45 °С (оптимум 37 °С); оптимум рН 6,5-7,2. Строгий аэроб. На жидких средах (например, МПБ с глицерином) первоначально образует мутную взвесь, а со 2-х суток начинает формировать пристеночный осадок и плёнки; затем культура выпадает в осадок, образующий (при вращении пробирки) тяжи, поднимающиеся кверху. С поверхностной плёнки на дно спускаются плёнки. При хранении среда полностью не просветляется. На полужидких средах (например, на желатине) наблюдают поверхностный сероватый налёт, прорастающий в верхнюю часть линии укола (иногда в месте укола наблюдают желтоватое окрашивание); желатин не разжижает. На плотных средах (например, агаре с глицерином) образует плоские полупрозрачные колонии, сливающиеся в прозрачный янтарный тягучий налёт. На свернувшейся сыворотке образует мелкие мутные беловатые колонии (среду не разжижает). Даёт характерный рост на картофельных пластинках — через 24 ч образует полупрозрачные колонии, позднее (через 6~8 сут) они сливаются, образуя полупрозрачные массы цвета мёда (пигментирование проявляется только на картофельных средах и варьирует от сероватого до буровато-красного). Независимо от цвета налёта колонии сохраняют прозрачность. Пигментообразование возможно только на картофельной среде.

Биохимия. Некоторые штаммы разлагают глюкозу, маннит, левулёзу, глицерин с синтезированием кислоты без газа; палочки не синтезируют индол и не восстанавливают нитраты. Синтезируют H₂S и аммиак на жидких средах; каталаза-положительны. Молоко свёртывают медленно (10-12 сут), образуя незначительное количество кислоты; пептонизацию молока не вызывают

Клинические проявления. Инкубационный период составляет 1-5 сут; заболевание начинается остро, с подъёмом температуры тела до 38-39 ⁰С (затем она приобретает значительную амплитуду, как при сепсисе), головной болью и артралгиями. В месте проникновения возбудителя последовательно образуются тёмно-красная папула, затем пустула с подрытыми краями и «сальным» дном. Часто формирование очагов сопровождает регионарный лимфангиит. Позднее (через 5-7 сут) отмечают вторичное множественное появление изъязвляющихся папул. Состояние больного резко ухудшается, обычно наблюдают проявления тяжёлой плевропневмонии с кровохарканьем, реже клиническую картину обусловливают абсцедирующие поражения других органов. Летальность при острой форме достигает 100%. Хроническое течение протекает в 3 формах — кожной, лёгочной и носоглоточной. Наиболее распространена кожная форма, сопровождаемая множественными «холодными» абсцессами. Их самопроизвольное вскрытие ведёт к образованию свищей с обильным отделяемым. При носоглоточной форме типичны слизисто-гнойное отделяемое, образование жёлто-зелёных корочек и распространение изъязвлений на зев и трахею. Лёгочные поражения проявляются ползучей плевропневмонией и мышечными абсцессами. Прогноз хронической формы также неблагоприятен; летальность может достигать 50% и выше.

Лабораторная диагностика основывается на выделении и идентификации возбудителя (рис. 9), а также на результатах кожных проб. Все исследования проводят в условиях, необходимых для работы с возбудителями особо опасных инфекции. Для исследования забирают мокроту, гной, кровь и отделяемое вскрывшихся абсцессов или биоптаты закрытых абсцессов. При невозможности немедленного проведения анализа материал консервируют внесением 30% раствора глицерина (хранить следует не более 10-15 сут при температуре 4 °С). Для подавления роста прочих микроорганизмов в среды вносят красители, например основной и кислый фуксины (1:100000), кристаллический фиолетовый (1:200000), бриллиантовый зелёный (1:1000000). При выделении подозрительных колоний проводят биологическую пробу на морских свинках (также можно использовать хомяков и кошек). Смешанную культуру вводят подкожно, чистую — внутрибрюшинно. На месте введения через 2-3 сут образуется опухоль-узелок, вскрывающаяся на 4-5 сутки с образованием язвы. На 3-10 сутки у морских свинок-самцов, заражённых внутрибрюшинно, развивается характерное поражение яичек (феномен Штрауса). Следует помнить, что феномен не патогномоничен для заболевания, и его можно вызвать заражением животных Pseudomonas aeruginosa. P. pseudomallei и другими микроорганизмами. Основные дифференцирующие признаки возбудителя: неподвижность, отсутствие способности образовывать газообразный азот, разжижать желатин и расти при температуре 42 °С. Кожная проба. При подозрении на сап больному внутрикожно (на внутреннюю сторону предплечья) вводят маллеин (бактериальный аллерген, полученный из культур Pseudomonas mallei) в разведении 1:100 (0,1 мл); реакция имеет больше эпидемиологическое значение, т.к. у больного положительная воспалительная реакция развивается на 2-3 неделе заболевания. Серологические исследования. Наличие AT в сыворотке больных выявляют РА со специальным штаммом (ориентировочная концентрация микроорганизмов суспензии не менее 1 млрд/мл), РСК (основная диагностическая реакция) и РИГА.

Poд Francisella

Francisella — род мелких кокковидных (до эллипсоидных) плеоморфных палочек; неподвижны, спор не образуют. Строгие аэробы; не растут на обычных средах; расщепляют некоторые углеводы с образованием кислоты, образуют H,S. Распространены во многих пресноводных водоёмах; могут паразитировать у человека, млекопитающих, птиц и членистоногих; род представлен видами Francisella novicida (известен один уникальный штамм, выделенный из озёрной воды в США) и Francisella tularensis (возбудитель туляремии — болезнь Фрэнсиса). Заболевание впервые описано японскими врачами (1837). До открытия Охарой (1925) новой бактерии, названной кокком Охары-Хаги, болезнь не связывали с конкретным возбудителем. Как возбудитель чумоподобной лихорадки земляных белок (Cytellus beechei) микроорганизм также выделили Маккой и Чёпин (1911) в районе озера Туляре (графство Туляре, штат Калифорния). Позднее была установлена эпидемическая связь заболевания с кровососущими членистоногими (1924), лишь в 1928 г. Фрэнсис доказал идентичность туляремии и болезни Охары. Нозогеогра-фически туляремия принадлежит к распространённым инфекциям: её регистрируют повсеместно в Северном полушарии (исключая Англию) в ареале между 30 и 70° с.ш. На территории РФ впервые официально зарегистрирована в 1926 г. (Астраханская область). Возбудитель дифференцируют на экологогеографические расы и варианты. Тип A (Nearctica) выделяют от многих грызунов и кровососущих насекомых; высоковирулентен для человека и кроликов; ферментирует глицерин, содержит цитруллинуреидазу. Тип распространён в Северной Америке; очень патогенен для человека; без лечения летальность 6%. Тип В (Palaearctica) выделяют из воды и от водных животных; маловирулентен для человека и кроликов; не ферментирует глицерин, не содержит цитруллинуреидазу. Возбудитель регистрируют в Европе и Азии; не ферментирует глицерин; умеренно патогенен для домашних кроликов и человека, вариант japonica выделяют в Японии (ферментирует глицерин), вариант mediasiatica вызывает заболевания в Средней Азии в дельтах рек Или и Аму-дарьи (ферментирует глицерин, содержит цитруллинуреидазу; умеренно патогенен для домашних кроликов и человека).

Эпидемиология. Francisella tularensis выделена от многих диких и домашних животных, а также птиц, рыб и земноводных. Основные источники заражения человека — обыкновенные полёвки (Microtus arvalis), домовые мыши (Mus musculus), водяные крысы (Arvicola terrestis), ондатры (Ondathra zibethica), а также зайцы, особенно русак (Lepus europeus) и беляк (L. timidus). Переносчики инфекции — кровососущие членистоногие: иксодовые к гамазовые клещи, блохи, слепни (оленьи мухи), комары, москиты. На юго-западе США бактерии выделяют из оленьих мух, на северо-западе — из лесных клещей. На востоке США возможными источниками инфекции для человека считают белок-летяг (Pteromyidae). Человек заражается от больных животных, кровососущих членистоногих или объектов внешней среды. Пути заражения: контактный (через кожу и слизистую оболочку глаз), инокулятивный (при укусе переносчика), алиментарный (через ЖКТ) и аспирационный (через дыхательные пути).

Морфология. Клетки Francisella tularensis — мелкие (размером 0,1-0,5 мкм) неподвижные капсулированные грамотрицательные палочки с выраженным полиморфизмом (от кокковидных до нитевидных форм), особенно у неарктических видов. В мазках из культур доминируют кокковидные формы, в мазках из органов — коккобактерии. Слабо воспринимают краситель и окрашиваются бледнее, чем прочие патогенные микроорганизмы; в мазках-отпечатках не дают биполярной окраски, что отличает их от возбудителя чумы. Размножаются почкованием. Отличий в микроструктуре клеток различных рас не отмечают; у авирулентных штаммов находят массированное подобие капсулы, у вирулентных — нестойкое слизистое вещество. Клеточная стенка имеет гладкие контуры. Колонии Francisella tularensis очень мелкие, в виде капелек беловатого цвета с голубоватым отливом. Колонии круглые, с ровным краем, выпуклые и блестящие. При разреженном посеве через несколько суток достигают диаметра 2 мм и более (рост становится заметным с 3-5 сут культивирования). Изолированные колонии удобно получать при посеве на среды Емельяновой или Маккоя, используют также агар с переваром сердечной мышцы, дополненный 5% крови барана или кролика. Колонии вирулентных штаммов по морфологии и биологическим свойствам соответствуют S-диссоциатам. На жидких средах размножаются хуже и только у поверхности среды, что связано, по-видимому, с аэрофильностью бактерий; более удовлетворительных результатов достигают аэрацией среды или внесением биоколлоидов (яичного желтка, агара и т.д.).

Культуральные свойства. Francisella tularensis можно отнести к факультативным анаэробам, однако оптимальный рост наблюдают только в аэробных условиях; температурный оптимум 36-37 °С. Бактерии культивируют на сложных агаровых или желточных средах с добавлением тканевых экстрактов, цистеина, кроличьей дефибринированной крови и других питательных веществ. Включение в питательную среду полимиксина В или пенициллина подавляет рост других микроорганизмов. Ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, левулёзу и маннозу (американские, среднеазиатские и японские штаммы дополнительно и глицерин), но определить эту способность можно только на специальных средах с ограниченным содержанием белка и точно определённым рН (на среде Хисса не растут); наиболее точные результаты ферментации углеводов и спиртов получают манометрией на аппарате Варбурга. Имеют следующие ферменты: каталазу, глутаминазу, аспарагиназу, дез- и трансаминазу, цитруллинуреидазу. Индол не образуют, редуцируют некоторые краски, например тионин, метиленовый синий, малахитовый зелёный и др. Работа с кровью, мокротой или аспиратами лимфатических узлов больного связана с большим риском для сотрудников лаборатории и предъявляет особые требования к её оснащению и квалификации персонала.

Патогенез. После проникновения возбудителя в организм его дальнейшее распространение происходит, как правило, с током лимфы и реже через кровоток, куда он попадает позднее (что создаёт угрозу генерализации). Фагоциты активно поглощают Francisella tularensis, но они не способны к их внутриклеточному киллингу, что создаёт предпосылки для депонирования бактерий в лимфатических узлах. Часть возбудителей при этом погибает, что сопровождается выделением эндотоксина, действующего на узел и окружающие ткани. Таким образом, вслед за стадией лимфогенного заноса развивается стадия очаговых реакций, в результате чего формируются туляремийные бубоны. По аналогии с чумой последние разделяют на первичные (возникают метастатически лимфогенно и связаны с местом входных ворот) и вторичные, а также на бубоны первого порядка, второго и т.д., учитывая время их появления. Периодически из сформированных очагов возбудитель проникает в лимфо- и кровоток, что сопровождается выделением новых порций эндотоксина и сенсибилизацией (регистрируют кожными пробами). Прорывы бактерий могут приводить к метастазированию в печень, селезёнку, лёгкие, костный мозг и другие органы, что обусловливает вторичные поражения (например, вторичную пневмонию, менингит и т.д.). Выделяют 4 главные клинические формы туляремии, обусловленные локализацией инфекционного очага: бубонную, лёгочную, генерализованную, желудочно-кишечную (абдоминальную). Важно помнить, что любая форма туляремии — заболевание всего организма со специфической эндотоксинемией и реактивными проявлениями со стороны различных органов и тканей. В неосложнённых случаях заболевание завершают обратный метаморфоз поражённых лимфатических узлов и выздоровление больного. Наиболее распространена бубонная форма, составляющая 70-85% всех случаев; развивается в результате внедрения возбудителя в кожу при укусе насекомого, при контакте с кровью и тканями инфицированного животного или его выделениями, а также при контакте с загрязнёнными объектами (сено, зерно) и купании. Клинически выделяют бубонную, язвенно-бубонную, ангинозно-бубонную и глазобубонную формы. В месте внедрения Francisella tularensis (обычно на пальцах или кисти руки) развивается первичный аффект. На 7 день после заражения открывается немного болезненная кратерообразная язва с твёрдыми, приподнятыми краями. Возможна глазо-бубонная форма туляремии с перфорацией роговицы. При укусах клещей первичный аффект чаще располагается на нижних конечностях. Регионарная лимфаденопатия развивается на 2-3 день болезни, одновременно с началом формирования язвы. Лимфатические узлы увеличиваются до размеров лесного ореха или куриного яйца, становятся резко болезненными. В 50% случаев они размягчаются и спонтанно дренируются, в другой половине случаев лимфатические узлы постепенно рассасываются или склерозируются. В 10% случаев туляремия не сопровождается возникновением первичного аффекта в месте внедрения возбудителя и классифицируется как бубонная форма.

  Лабораторная диагностика. Предположительный диагноз основывают на соответствующем анамнезе и клинических проявлениях. Наиболее достоверные результаты даёт выделение Francisella tularensis, однако культивирование возбудителя сопряжено не только с трудностями, но и с угрозой заражения персонала и разрешено только в лабораториях особо опасных инфекций. При отсутствии возможности выделения возбудителя используют биологический метод, основанный на заражении лабораторных животных (мышей или морских свинок) патологическим материалом (пунктат бубона, слизь из зева, гнойное отделяемое слизистой оболочки глаза, кровь и т.д.) с последующей идентификацией микроба агглютинирующей сывороткой. Материал из бубона следует брать до 14-20 сут болезни, из слизистой оболочки глаза — до 17 сут, кровь — до 6 дня заболевания. Серологические методы. Наличие AT к Francisella tularensis в сыворотке больного определяют в реакции агглютинации с туляремийным диагностикумом; положительной считают видимую глазом реакцию при разведении сыворотки 1:100 и больше (положительные результаты на 1 неделе выявляют у 12,5% больных, на 4 — у 93,2%). Возможна экспресс-диагностика, основанная на идентификации Аг в мазках из очагов поражений AT, меченными флюоресцеинами. Для ранней диагностики эффективна аллергическая кожная проба. В качестве Аг используют тулярин — взвесь бактерий, убитых нагреванием до 70 °С. Препарат вводят внутрикожно в объёме 0,1 мл (100 млн микробных тел), учёт производят через 24-48-72 ч. Следует помнить, что проба остаётся положительной и у лиц, переболевших туляремией.

Род Yersinia

Общая характеристика. Род Yersinia организован в 1944г. и назван (по предложению ван Лбгхема) в честь Александра Иерсэна. Включает подвижные и неподвижные споронеобразующие палочки (иногда коккобациллы) размерами 1-3x0,5-0,8 мкм. Бактерии неподвижны при 37 ⁰С, но подвижны при выращивании с температурным режимом ниже 30 °С (подвижные виды имеют перитрихи). Некоторые штаммы Y. ruckeri и все изоляты Y. pestis неподвижны (но броуновское движение очень выражено) и имеют капсулу, а остальные виды - капсульное вещество. Факультативные анаэробы; метаболизм окислительный и бродильный; паразиты человека и животных. Температурный оптимум — 25-28 °С; оксидаза отрицательны и каталаза-положительны; образование индола варьирует у разных видов; большинство изолятов даёт положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра при 37 "С, но вариабельную при 25-28 °С. Большинство не образует лизин дигидролазу и аргинин декарбоксилазу, но синтезируют орнитин декарбоксилазу (исключая Y. pestis, У. pseudotuberculosis и Y. rohdei). He образуют H₂S; проявляют уреаз-ную активность (исключая Y. pestis, Y. bercovieri и Y. ruckeri). Хемоорганотрофы, хорошо растут на простых питательных средах; ферментируют большинство углеводов (исключая лактозу) без образования газа; не сбраживают дульцит, эритрит, фукозу, гликоген, инозит, рафинозу; проба с метиленовым синим положительна. Род включает 11 видов (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y.frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei и Y. ruckeri); типовой вид — Y. pestis. При идентификации следует помнить, что иерсинии способны существенно изменять свой метаболизм в зависимости от температуры. Иерсинии широко распространены в природе; некоторые из них — паразиты различных животных (особенно грызунов и птиц) и человека; их также выделяют из почвы, воды и пищевых продуктов. Y. pestis вызывает чуму, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica патогенны для различных животных и иногда для человека, вызывая брыжеечный лимфаденит, хроническую диарею и тяжёлые септицемии; Y. ruckeri вызывает «болезнь красного рта» у рыб, прочие виды не патогенны либо вызывают оппортунистические инфекции у человека.