Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Род Eikenella

Род Eikenella образуют прямые палочки размерами 1,5-4,0x0,3-0,4 мкм; иногда образуют короткие нити. Спор не образуют, неподвижны (на поверхности плотных сред можно обнаружить «дёргающуюся» подвижность). Факультативные анаэробы; температурный оптимум 35-37 °С. Свежие колонии могут приводить к коррозии среды; гемолитическая активность отсутствует, но могут вызвать зелёное окрашивание КА. Оксидаза-положительны; каталаза-, уреаза- и аргинин дигидролаза-отрицательны. Индол не образуют; декарбоксилируют лизин; восстанавливают нитраты; инертны к углеводам. Для роста в аэробных условиях нуждаются в присутствии геми-на. Типовой вид — Е. corrodens. Дифференциальные признаки представлены в табл. 14-8. Е. corrodens входит в состав микрофлоры ротовой полости, верхних отделов дыхательных путей и кишечника. Основной фактор, предрасполагающий к развитию поражений, — травмы с нарушением целостности слизистой оболочки, дающие возможность бактериям проникать в прилежащие ткани и кровоток. Эйкенеллы часто выделяют в составе микробных ассоциатов при абсцессах головы, шеи, органов брюшной полости. Реже регистрируют моноинфекции — септицемии (особенно после удаления зубов, у лиц с иммунодефицитами и наркоманов), эндокардиты, пневмонии, инфекции после хирургических вмешательств и др. Материал для исследования —  гнойное отделяемое или аспираты из очагов гнойного воспаления, СМЖ и синовиальная жидкость. В аэробных условиях медленно развивается только на средах, содержащих кровь; рост стимулирует создание капнофильных условий (3-10% С0₂). Через 48ч образует мелкие (0,5-1,0 мм), желтоватые, сухие, плоские колонии с неровными краями. Культуры иногда приводят к зелёному окрашиванию среды и имеют характерный «известковый» запах. Более половины изолятов вызывает коррозию среды. На жидких средах растут плохо; на 3-4 сут при 35 °С образуют зернистое кольцо на глубине 1 см от поверхности. При индикации следует помнить, что Е. corrodens неподвижна, оксидаза-, лизин декарбоксилаза- и орнитин декарбоксилазаполо-жительна; большая часть изолятов каталаза-отрицательна; восстанавливает нитраты; не образует уреазы, индол и НД Бактерии чувствительны к тетрациклинам, ампициллину, цефалоспори-нам 2-го и 3-го поколений; резистентны к клиндамицину и аминогликозидам.

Poд Bacteroides

Представлен вариабельными по своим размерам палочковидными бактериями. Отличаются высокой степенью полиморфизма, морфология варьирует от коккобациллярных до ветвящихся форм. Спор не образуют. Облигатные анаэробы, большинство неподвижно, хемоорганотрофы, рост в культуре стимулирует внесение гемина и витамина К. Некоторые виды вызывают поражения у человека. Типовой вид — Bacteroides fragilis, составляющий наиболее многочисленный вид бактерий толстой кишки (до 99% всей микрофлоры). Патогенез поражений, вызванных бактероидами, включает адгезию к поверхности эпителия и выделение различных продуктов, повреждающих его. Например, B.fragilis секретирует нейраминидазу, гиалуронидазу и фибринолизин. Микроорганизм снабжён капсулой и способен выделять супероксид дисмутазу, защищающие его от вне- и внутриклеточных микробицидных факторов фагоцитов. Все бактероиды содержат эндотоксин, отличающийся по структуре от ЛПС других грамотрицательных бактерий и проявляющий умеренную биологическую активность. Тем не менее бактероиды редко вызывают моноинфекции, гораздо чаще они обусловливают смешанные поражения, вызванные ассоциациями с анаэробными стрептококками, фузобактериями и др. Несмотря на многообразие поражений, вызываемых бактероидами, основные среди них — абсцессы. Локализация последних может быть различной, но доминируют поражения органов брюшной полости.

Лабораторная диагностика. Принципы получения и транспортировки образцов аналогичны таковым при подозрении на анаэробную инфекцию (следует избегать контакта образца с атмосферным воздухом). Наиболее оптимально получение аспирата и транспортировка содержимого в шприце с выдавленным воздухом. При необходимости исследования мазков последние транспортируют в специальных контейнерах, лишённых доступа воздуха. Впрочем способность B. fragilis синтезировать супероксид дисмутазу позволяет бактериям избегать токсического действия кислорода при непродолжительном контакте с атмосферным воздухом. Бактероиды культивируют на КА, тиогликолевой среде; они лучше растут на комплексных средах (например, агаре с экстрактом мозга) в анаэробных условиях при 10% содержании СО₂ в атмосфере. Образуют жемчужно-серые или белые колонии. Рост стимулирует внесение в питательную среду гемина и витамина К (для бактерии группы В. fragilis не являются необходимыми). Протеолитические свойства умеренные, лецитиназу не образуют, не лизируют эритроциты, гиппурат не гидролизуют (родовой признак), образование индола непостоянно.

 Бактерии группы В. fragilis (В. thetaiotaomicron, В. ovatus, В. vulgatus, В. distasonis). В мазках из клинического материала представлены бледными полиморфными палочками с закруглёнными концами. Как правило, каталаза положительны. Содержат вакуоли и часто неравномерно окрашиваются по Граму. На КА образуют серовато-белые, прозрачные или мутноватые негемолизирующие S-колонии 1-4 мм в диаметре. За счёт наличия капсулы В. fragilis может формировать более сочные и блестящие колонии; В. ovatus чаще образует слизистые колонии, а колонии В. thetaiotaomicron обычно белого цвета. Ключевые признаки группы — способность расти в присутствии 20% содержания жёлчных солей и резистентность к канамицину (100 мкг), ванкомицину (5 мкг) и колистину (10 мкг). На твёрдых средах с жёлчью колонии могут быть окружены осадком жёлчных солей. Анти-биотикорезистентность проверяют методом дисков, зоны задержки роста протяженностью менее 10 мм указывают на отсутствие чувствительности. Лабильны к антимикробному действию производных имидазола и азолов.

Прочие виды бактероидов. Клетки В. urealyticus и В. gracilis тонкие, с закруглёнными концами. На КА образуют мелкие полупрозрачные колонии, у некоторых изолятов — распластанные на поверхности. Вызывают зелёное окрашивание и коррозию среды. Для нормального роста нуждаются во внесении в среду фумаратов и формиатов. В. ureolyticus уреаза-положитель-на, В. gracilis — отрицательна. Ключевые признаки группы — отсутствие способности расти в присутствии 20% содержания жёлчных солей, резистентность к канамицину (100 мкг) и колистину (10 мкг), но чувствительность к ванкомицину (5 мкг)

Poд Prevotella

Представлен полиморфными неподвижными споронеобразующими палочками, близкими к бактероидам (Шах, Коллинз, 1990). Хемоорганотрофы, облигатные анаэробы; проявляют умеренную сахаролитическую активность. Основные продукты ферментации углеводов -сукцинаты и ацетаты. Типовой вид — P. melaninogenica. Патогенез поражений во многом обусловливает эндотоксин, активность которого превышает действие ЛПС бактероидов (особенно у P. bivia). P. melaninogenica и P. intermedia также выделяют фосфолипазу А, нарушающую целостность мембран эпителиальных клеток, что вызывает их гибель.

Лабораторная диагностика. Принципы получения образцов клинического материала аналогичны таковым при любой анаэробной инфекции. В мазках превотеллы напоминают пор-фиромонады. На КА образуют пигментированные (от светло-коричневого до чёрного) колонии. Их морфология может быть различной например, P. intermedia образуют коричневато-чёрные сухие колонии, а колонии P. melaninogenica, P. loescheii и P. denticola — коричневые, гладкие и блестящие (что обусловлено наличием капсул)]. Следует помнить, что обычно пигмент образуется не ранее чем через 5-14 сут культивирования на агаре с кроличьей кровью. До образования пигмента колонии некоторых изолятов могут флюоресцировать ярко-красным цветом при проходящем УФ-облучении. Ключевые признаки превотелл: жёлчные соли (20%) ингиби-руют рост, бактерии чувствительны к колистину, но резистентны к ванкомицину и канамицину.

Calymmatobacterium granulomatis

Возбудитель заболевания, характеризующегося образованием язв и вегетации на кожных покровах половых органов, также известного как донованоз, паховая (венерическая, Брака) гранулёма или пятая венерическая болезнь. Заболевание впервые описано Маклёодом (1882); возбудитель был выделен Донованом (1905) и получил название Calymmatobacterium (Donovania) granulomatis (палочка Арагао-Вианны). С. granulomatis — неподвижная факультативно анаэробная палочка размером 0,5-1,5x1,0-2,0 мкм с закруглёнными концами. Биполярно окрашивается по Грому, биполярное скопление хроматина придаёт клетке характерный вид «английской булавки». Имеет капсулу; температурный оптимум — 37 ⁰С. Требовательна к условиям культивирования; можно выращивать в желточных мешках куриных эмбрионов либо на специализированных желточных средах (крайне затруднительно); до настоящего времени не выделено ни одного изолята, пригодного для стабильного культивирования и лабораторного изучения. Желатин не разжижает, сворачивает молоко. Окраской отделяемого из очагов поражения по Грому или Райту выявляют одиночные палочки или их скопления в цитоплазме фагоцитов (тельца Донована). Патогенна при внутрибрюшинном введении лабораторным животным (погибают через 24-48 ч), но не вызывает развития характерных поражений. Аг полисахаридов капсулы дают перекрёстные реакции с видами Klebsiella, но таксономическое родство бактерий не доказано.

Эпидемиология. Паховая гранулёма — умеренно контагиозное заболевание, распространённое на Новой Гвинее и Антильских островах, в Индии, Центральной Австралии, а также во многих тропических и субтропических регионах. Отдельные случаи зарегистрированы в США, странах Европы, Японии, но в большинстве случаев они имеют завозной характер. Принято считать, что заболевание передаётся половым путём, однако существуют убедительные факты, указывающие, что половые контакты далеко не всегда приводят к инфицированию. Кроме того, на Новой Гвинее установлена возможность передачи возбудителя детям 1-4 лет (4% заболевших) при сидении на коленях у больных лиц.

Клинические проявления. Инкубационный период 8-80 сут, первичные поражения полиморфны (папулы, пустулы, эрозии) и распространяются на область наружных половых органов, паха и промежности. Позднее поражения образуют характерные болезненные, легко кровоточащие язвы и папиломатозные грануляции. Лимфаденитов, как правило, не наблюдают. Заболевание может протекать хронически в течение многих лет без выраженных нарушений общего состояния. Как следствие заболевания развиваются стриктуры мочеиспускательного канала и влагалища, ректально-вагинальные фистулы, слоновость наружных половых органов; в некоторых случаях больные погибают в результате генерализации процесса и поражения различных органов, а также вследствие сепсиса, вызванного глубоким некрозом тканей половых органов, промежности и прямой кишки. При гистологическом исследовании очагов поражения выявляют гранулематозную реакцию с инфильтрацией нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами. Последние содержат значительные количества телец Донована.

Лабораторная диагностика основана на выявлении телец Донована микроскопией мазков биоптатов и отделяемого из очагов, окрашенных по Райту, Романовскому-Гимзе или Ди-терле. Следует помнить, что при фиксации материала нельзя применять формалин, разрушающий бактерии.

Afipia felis

Род Afipia образован сравнительно недавно (1991), включает подвижные неферментирующие палочковидные бактерии (снабжены одним полярным, субполярным или боковым жгутиком) — A. clevelandensis, A. broomeae и A. felis, а также ещё 3 недифференцированных вида. Оксидаза- и уреаза-положительны; гемолитических свойств не проявляют, образуют индол и H₂S, гидролизуют желатин и эскулин. Инертны к углеводам (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза). Температурный оптимум 25~30 ⁰С, при 42 ⁰С не растут. Прихотливы, на твёрдых средах (забуференный угольный агар с дрожжевым экстрактом, КА) образуют сероватые выпуклые мутные колонии диаметром 0,5-1,5 мм; для культивирования также можно использовать культуру клеток HeLa. Практически все виды патогенны для человека: A. broomeae периодически выделяют из гнойного отделяемого, A. clevelandensis — из биоптатов поражений большебер-цовых костей, недифференцированные виды — из плевральных экссудатов, промывных вод бронхов и т.д. Однако возбудителем конкретной патологии, известной как болезнь кошачьих царапин (гранулёма Молларе), считают только A. felis. Следует отметить, что роль микроорганизма в развитии данного заболевания остаётся предметом дискуссии. Тем не менее первые случаи были выявлены Ровером Дебре в Париже в начале 30-х гг., но лишь в 1983 г. Уир с коллегами выделил мелкие полиморфные грамотрицательные палочки в биоптатах лимфатических узлов и предположил её роль как этиологического агента. Относительно недавно возбудитель удалось вырастить на искусственных средах, и он был систематизирован как A. felis (1991).

Эпидемиология изучена недостаточно. Резервуаром и переносчиком инфекции считают различных млекопитающих (кошек, собак, обезьян и др.). Заболевание регистрируют повсеместно в регионах с умеренным климатом, подъём заболеваемости отмечают с сентября по март. Преобладающий возраст (учитывая характер инфицирования) — до 21 года; у 90% больных в анамнезе отмечают укусы или царапины, нанесённые котятами. Исследования, проведённые на животных, показали, что микроорганизм не вызывает у них развитие какой-либо патологии, и они не отвечают развитием реакций гиперчувствительности при внутрикожном введении Аг возбудителя.

Патогенез типичных поражений весьма напоминает аналогичные проявления, наблюдаемые при бруцеллёзе, туляремии, микобактериозах и паховом лимфогранулематозе.

Клинические проявления. Через 3-10 сут в месте укуса или царапины, нанесённой животным, формируется папула или пустула, не причиняющая значительного беспокойства и часто остающаяся незамеченной. Через 2 нед развивается типичный регионарный лимфаденит, наиболее часто отмечают увеличение лимфатических узлов шеи и головы, реже — паховых. бедренных, подмышечных и др. В 80% случаев наблюдают увеличение одного узла. В зависимости от его анатомической дислокации можно наблюдать боли в горле, подмышечной области, паху и др. 30% больных жалуются на лихорадочное состояние и головные, боли. Длится 2-3 мес и проходит спонтанно. Серьёзную опасность представляют атипичные проявления заболевания — синдром Парино, энцефалиты и энцефалопатии, печёночные гранулёмы и остеиты, развивающиеся через 1-6 нед после появления аденопатии. У лиц с иммунодефицитами заболевание принимает генерализованный характер. У пациентов со СПИДом оно принимает форму диссеминированных кожных поражений, весьма напоминающих саркому Капоши также отмечают поражения костей и различных органов.

Лабораторная диагностика. При наличии соответствующих данных анамнеза проводят посев на питательные среды для исключения прочих возможных патогенов, ставят кожные пробы со специфическим Аг (положительны у 90% пациентов через 3-4 нед от начала болезни) и проводят гистологическое исследование биоптатов лимфатических узлов, окрашенных по Уортину—Cmаppu. Вполне пригодна окраска по Граму; однако следует помнить, что в лимфатических узлах возбудитель присутствует не на всех стадиях болезни. Выделение возбудителя обычно не проводят.

Poд Treponema

род Treponema представлены спиральными бактериями длиной 5-20 мкм, образующими туго закрученные правильные или неправильные спирали; грамотрицательны, хорошо окрашиваются методом импрегнации серебром, но плохо по классическому методу Романовско-го-Гимзе. Хемоорганотрофы, метаболизм бродильный (с утилизацией аминокислот и/или углеводов), анаэробы или микроаэрофилы; каталаза, уреаза- и оксидаза отрицательны, реакция Фогеса-Проскауэра отрицательная, не восстанавливают нитраты. Патогенные для человека бактерии — Т. pallidum, T. pertenue, T. bejel, T. carateum и Т. vincentii. Патогенные трепонемы дифференцируют по патогенности для лабораторных животных, способности сбраживать маннит, утилизировать лактат и образовывать специфические метаболиты. Исследования ДНК-гомологии позволили систематизировать Т. pertenue и Т. bejel (ранее считавшиеся отдельными видами) как подвиды Т. pallidum. Соответственно выделяют Т. pallidum подвид pallidum, Т. pallidum подвид pertenue и Т. pallidum подвид endemicum. А. Т. pallidum подвид pallidum. Возбудитель сифилиса — хронического венерического заболевания с вариабельным и цикличным течением. Заболевание поражает все органы и ткани организма. Европейские врачи столкнулись с сифилисом после открытия испанцами Нового Света (точнее, после второй экспедиции Колумба в 1493 г.). Особое распространение заболевание получило во время итальянской кампании Карла VIII (1494), т.к. французские войска включали большое число испанских наёмников. Поэтому заболевание фигурировало под названием «французская или итальянская (неаполитанская) болезнь». О значимости заболевания свидетельствует тот факт, что именно ему Фракасторо посвятил свой первый поэтический трактат (1525), в котором описал заболевание у пастуха Сифилу'са, чьё имя стало нарицательным для болезни. Достаточно быстро была установлена венерическая эпидемиология сифилиса, и уже в 1575 г. Паре назвал его «Lues Venera», т.е. «любовная чума». Однако возбудитель сифилиса был выделен лишь в 1905 г. Шаудинном и Хоффманном, что было экспериментально подтверждено И.И. Мечниковым и Ру (1905).