Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

 Морфология. Наиболее часто клетки иерсинии имеют овоидную форму (коккобациллы), окрашиваются биполярно (может служить дифференциальным признаком при исследовании на Y. pestis). Палочки склонны к полиморфизму, образуя в субоптимальных условиях нитевидные, колбовидные или шарообразные (инволюционные) формы (например, на агаре с 3% содержание поваренной соли). Для Y. pestis характерны морфологически обособленное ядро, наиболее хорошо видимое у инволюционных гигантских клеток, и отсутствие подвижности. Виды Yersinia образуют серовато-слизистые (S-формы) или шероховатые (R-) колонии; также выделяют переходные формы. Вирулентные штаммы образуют R-колонии. Микроскопическое изучение колоний Y. pestis выявляет колонии двух типов: молодые — микроколонии с неровными краями («битое стекло»), позднее они сливаются, образуя нежные плоские образования с фестончатыми краями («кружевные платочки»); зрелые — крупные с бурым зернистым центром и неровными краями («ромашки»). Многие, особенно вирулентные штаммы, Y. pestis, способны образовывать тёмный пигмент, восстанавливать красители (янус зелёный, индиго, метиленовый синий) в лейкоформу в реакциях дегидрирования. На скошенном агаре через 48 ч при 28 °С образуют серовато-белый налёт, врастающий в среду. На бульоне через 48 ч образуют нежную плёнку на поверхности и хлопьевидный осадок, при выращивании в аэрированном бульоне дают гомогенный рост; также хорошо растут на желатине, не вызывая её разжижения.

Культуральные условия. Температурные пределы роста иерсиний варьируют от 0 до 39 °С (для Y. pestis до 45 °С); оптимум роста — 28-30 °С; температура 37 °С — селективная для образования капсулы Y. pestis. Границы рН для роста — в пределах 5,8-8,0; оптимум рН -6,9-7,2. Хорошо растут на простых питательных средах; медленный рост бактерий (до 3 сут) можно ускорить добавлением гемолизированной крови или сульфата натрия (Y. pseudotuberculosis практически не растут на среде Плоскирева). Наиболее благоприятная температура для выделения Y. enterocolitica — 22-29 ⁰С. На средах для изучения подвижности (например, содержащих индол и орнитин) Y. enterocolitica неподвижны или малоподвижны при 35 °С и подвижны при 25 ⁰С.

Эпидемиология. Для всех иерсиний первичные (основные) хозяева — животные, вторичный (случайный) хозяин — человек. Способы передачи инфекции от животных человеку и степень вовлечения в патологический процесс различных органов и систем у человека вариабельны.

Чума.

 Y. pestis вызывает чуму (от арабского «джумма») — антропозооноз, поражающий грызунов (основной природный резервуар) и проявляющийся спорадическими вспышками или эпидемиями (эпизоотии). Человеку передаётся через блох, а также контактным, алиментарным и аспирационным путями; также опасны вторично загрязнённые объекты и трупы. Эпидемии чумы известны с III в. до н.э., иногда они приобретали характер пандемий. Первая достоверная пандемия 527-565 гг. («юстинианова чума»), начавшаяся в Египте и Эфиопии, привела к огромным потерям среди населения Восточной Римской империи, но самой опустошительной была вторая пандемия чумы в XIV-XV вв., вошедшая в историю под названием «великой» или «чёрной» смерти и унесшая около 60 миллионов жизней, только в Европе погибло более 25 миллионов человек. Как последствие второй пандемии рассматривают эпидемию чумы в Лондоне (1664-1665 гг.), повлекшую смерть 20% населения. Третья пандемия началась в Гонконге в 1894 г., продолжалась около 20 лет и унесла жизни 10 миллионов человек. В самом её начале были сделаны важные открытия (выделен возбудитель, доказана роль крыс в эпидемиологии чумы), что позволило организовать профилактику на научной основе. Возбудитель чумы обнаружили Т.Н. Минх (1878) и независимо Йерсин и Китазато (1894). Большой вклад в изучение эпидемиологии чумы внесли исследования Л.М. Исаева и Н.Н. йюдницкого, а также И.И. Мечникова, руководившего работой противочумных отрядов в Астраханской губернии (1911 г.). В 40-х гг. в Северной Африке была отмечена последняя эпидемическая вспышка; тем не менее, с 1958 по 1979 гг. в мире зарегистрировано 47 000 случаев чумы. Последние вспышки были в Индии (вторая половина 90-х гг.)

В эпидемиологическом отношении первое место занимают крысы (как самые распространённые и многочисленные грызуны); основную роль играют три вида — серая крыса-пасюк (Rattus norvegicus), чёрная крыса (Rattus rattus) и египетская крыса (Rattus alexandrinus)', чумные эпизоотии среди крыс обычно предшествуют заболеваниям людей. В степных регионах (где крыс мало) ведущую роль играют суслики, сурки и песчанки; общий список диких грызунов включает около 240 видов и подвидов, не считая синантропных крыс и мышей. При эпизоотиях среди мышей определённая роль в переходе заболевания на людей может принадлежать кошкам. Природный резервуар чумы на Западе США создают грызуны луговые собачки рода Cynomys, древесные крысы рода Neotoma и белки (Sciurus). Длительное время господствовало мнение, что чума (городская чума) среди синантропных крыс первична, а в дикой природе (дикая чума) -вторична, однако выявление эндемичных очагов в областях, практически свободных от крыс (например, в провинциях Северной Индии), показало ошибочность подобных воззрений. Группу риска по заболеваемости «дикой» чумой составляют охотники и заготовители животного сырья. Часто «дикая» чума и большинство случаев «городской» чумы протекают в виде бубонных поражений.

В передаче чумы человеку ведущую роль играют взрослые особи крысиных блох (Xenopsylla cheopsis), пожизненно сохраняющие возбудителя (общий список видов и форм блох, из которых выделяют возбудителя, насчитывает около 100 видов). Повсеместное вытеснение пасюком чёрной крысы сыграло, применительно к эпидемиологии чумы, положительную роль. На серых крысах паразитируют блохи Ceratophilus fasciatus, живущие преимущественно в норах грызунов, а не в их шерсти и гораздо реже перебирающиеся на человека, чем блохи чёрных крыс. Показано, что человек заражается не столько при укусе, сколько после втирания в кожу её фекалий или масс, срыгиваемых при питании. Установлено, что бактерии, размножающиеся в кишечнике блохи, выделяют коагу-лазу, способствующую образованию «пробки» (чумной блок), препятствующей поступлению крови в её организм. Попытки голодного насекомого к кровососанию сопровождаются срыгиванием заражённых масс на поверхность кожи в месте укуса. В жилищах человека блохи также могут переносить заболевание от человека к человеку.

Клинические проявления. Чума. Инкубационный период заболевания — 3-6 сут (при эпидемиях или септических формах сокращается до 1-2 дней). Заболевание начинается внезапным подъёмом температуры тела с головной болью и чувством разбитости; характерен налёт на языке («натёртый мелом язык»), его отёк, в результате чего речь становится невнятной; в более тяжёлых случаях развивается галлюцинаторное состояние. Наиболее часто возбудитель внедряется через кожные покровы, но только в 3-4% случаев отмечают местную реакцию в виде высоко инфекционных пустулы и карбункула (кожная чума). Чаще чумная палочка не вызывает воспалительных изменений кожи и мигрирует в ближайший лимфатический узел. В течение 2-6 дней в лимфатическом узле развивается серозно-геморрагическое воспаление, и формируется резко болезненный бубон. Нередко наблюдают присоединение регионарного бубона к кожной чуме, что даёт кожно-бубонную форму чумы. Патогенетически различают первичные (всегда связаны с местом входных ворот инфекции) и вторичные бубоны (возникают лимфогенно). По клиническим проявлениям выделяют: преимущественно локальные формы (кожная, кожно-бубонная и бубонная), генерализованные или внутренне-септические формы (первично- и вторично септическая), внешне диссеминированные формы (первичная и вторичная лёгочная, кишечная).

Бубонная чума. При данной форме заболевания кардинальный признак — бубон (чаще подмышечный или паховый), ранний признак — ощущение сильной боли в месте будущего бубона (часто больной вынужден принимать неестественные позы). Увеличиваясь до 10 см в диаметре, бубон размягчается, может нагноиться и спонтанно дренироваться. В случае развития геморрагического некроза лимфатического узла и утраты барьерной функции в кровоток поступает большое количество бактерий, что ведёт к вторичной чумной пневмонии и/или генерализованному чумному сепсису. Вторичная лёгочная чума (как осложнение) составляет 5-10% бубонных поражений и резко утяжеляет состояние больного; регистрируемый иногда (вследствие генерализации) вторичный чумной менингит, как правило, заканчивается смертью больного. Смертность без лечения при бубонной чуме достигает 75%.

Лабораторная диагностика. Наиболее достоверный результат, подтверждающий диагноз, получают выделением иерсиний из патологического материала. Данные бактериологических исследований не менее важны для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих с лихорадкой, лимфаденопатиями и энтероколитами.

 Исследуемый материал. У больного с подозрением на чуму исследуют отделяемое бубона (при бубонной форме), содержимое язвы или других кожных поражений (кожная форма), мокроту и слизь из зева (лёгочная форма), кровь (все формы), фекалии и СМЖ (при поражениях кишечника или мозговых оболочек). Материал следует получить до начала антибиотикотерапии. Выделение Y. pestis проводят по стандартной схеме. Идентификация вида осуществляется биохимическими и серологическими методами. Для проведения ускоренной диагностики заболевания можно использовать чумной бактериофаг. Бактериофаг Y. pestis выделяют из различных источников, включая ткани больного человека и животных, а также блох. Многие авторы связывают естественное быстрое угасание заболевания в очаге с наличием бактериофага. Его высокая специфичность и вирулентность для чумной палочки позволяют применять его для идентификации чумы внесением в исследуемый материал перед посевом либо по увеличению титра бактериофага в среде. Для быстрого обнаружения также применяют AT, меченные флюоресцинами (позволяют обнаружить Y. pestis в различных объектах в течение первых 2 ч исследования), реакцию нейтрализации AT, реакцию преципитации в стандартных агаровых пластинках и метод ускоренного роста Y. pestis на средах обогащения. Также разработаны методы, ускоряющие биологическую пробу, например введение заражённым животным глкжокортикоидов или куриного желтка, что позволяет ускорить диагностику чумы в случаях снижения вирулентности или при применении малой заражающей дозы.

Род Gardnerella

Род Gardnerella образован монотипным видом Gardnerella vaginalis; микроорганизмы ранее относили к роду Haemophilus (Гарднер и Дъюкс, 1955), но существенные отличительные признаки (независимость от Х- и V-факторов роста) побудили выделить их в отдельный род. Факультативные анаэробы (также существуют строго анаэробные штаммы); содержание Г+Ц в ДНК 42±1,0%.

Морфология и химический состав. Представлены бациллами и коккобациллами размерами 0,3-0,6x1-2 мкм. Выраженный полиморфизм отсутствует, нитевидных форм не образуют. В мазках клетки располагаются одиночно или парами (конец к концу); иногда наблюдают расположение в виде палисада или римской цифры «V», что более характерно для коринебактерий (отсюда устаревшее и неудачное название Corynebacterium vaginalis), чем для гемофильных палочек. По Граму могут окрашиваться неодинаково и неравномерно; некоторые клетки способны удерживать окраску по Граму, более заметную в молодых (8-12 ч) культурах; на свернувшейся сыворотке склонны окрашиваться грамположительно. Иногда образуют суданофильные включения. Окраской по Hduccepy выявляют метахроматические гранулы. Не ветвятся; капсул, жгутиков не имеют; спор не образуют; кислотонеустойчивы. Структура клеточной стенки с признаками грамположительных бактерий; в её составе присутствуют треонин, триптофан, лизин, глутами-новая и аспарагиновая кислоты, но арабиноза (что характерно для коринебактерий), тейхоевые и диаминпимелиновая кислоты отсутствуют. По составу жирных кислот превалируют гексаде-кановая, октадеценовая и октадекановая кислоты, но отсутствуют гидроксилированные жирные кислоты, характерные для грамотрицательных бактерий

Культуральные свойства. Температурный оптимум 35-37 °С, но могут расти и при 25-42 ⁰С; оптимум рН 4,0; предпочтительно инкубировать при повышенном содержании СО,. На обычных диагностических средах не растут; не растут или дают слабый рост на КА. Требуют наличия в среде биотина, фолиевой кислоты, ниацина, тиамина и рибофлавина, а также двух или более пуринов и пиримидинов; рост стимулируют ферментируемые углеводы и некоторые пептоны. Гемолитические свойства варьируют: не гемолизируют эритроциты барана, слабо разрушают эритроциты лошади. На средах, содержащих эритроциты человека или кролика, дают (в зависимости от свойств штамма) α- или (β-лизис. Для выделения культур наиболее пригодны среда КДС-1 с кровью человека и «V» (vaginalis) агар. Но вполне удовлетворительные результаты можно получить, используя стандартную сухую среду для выделения гонококков, дополненную 5% крови человека, или (при отсутствии крови) пептон-крахмал-глюкозный агар (вследствие гидролиза крахмала колонии окружены зонами просветления). Рост на твёрдых средах. Через 24-48 ч образуют мелкие (0,1-0,2 мм), круглые выпуклые гомогенные гладкие и бесцветные колонии. При дальнейшем культивировании могут достигать 1 мм, становятся тусклыми и матовыми; дальнейшей дифференцировки не происходит. На средах с кровью колонии окружены зоной гемолиза, при дальнейшем культивировании среда может приобретать шоколадный цвет. Не дают роста на поверхности в нескольких верхних миллиметрах столбиков и полужидких сред; небольшие инокуляты способны образовывать дискретные колонии; рост усиливается к дну. Жизнеспособность низкая — могут погибать через 24-48 ч, на полужидких средах могут существовать 7 сут и более. В жидких средах дают равномерное помутнение и осадок.

Биохимические свойства. Хемоорганотрофы, метаболизм бродильный; главный продукт брожения — уксусная кислота, но некоторые штаммы способны образовывать молочную, янтарную и муравьиную кислоты. Каталаза-отрицательны, образование пероксидаз варьирует. Чувствительны к действию перекиси водорода (в тесте ингибирования на агаре).

Клинические проявления. Бактериальный вагиноз составляет до 40% всех случаев вагинитов (кандидозные и трихомонадные — до 30%); у значительной части женщин отмечают бактериальную моноинфекцию (термин относителен, т.к. при гарднереллёзах выделяют и другие бактерии, например, бактероиды). Больные жалуются на зуд и жжение; основной симптом — выделения с неприятным «рыбным» запахом (40-50%), обусловленным образованием аномальных аминов (присутствуют в виде солей). У части женщин протекает бессимптомно. Гарднереллёз верхних половых путей. Может протекать в острой, хронической и рецидивирующей формах; обусловлен проникновением бактерий в полость матки, маточных труб и яичники. В норме попавшие туда гарднереллы не выживают, но под влиянием упомянутых факторов способны вызвать воспалительные поражения, вплоть до поражений брюшины. Наиболее часто подобные поражения формируются в ассоциации с другими патогенами и более точно отражают их общие клинические проявления, например, воспалительное заболевание малого таза или эндометрит-сальпингооофорит. У подобных больных может развиться послеродовая бактериемия, хориоамниониты или септические аборты. Гарднереллёз мочевых путей. Анатомические особенности женской уретры обусловливают почти обязательное её инфицирование при гарднереллёзном вагинозе, вызывая геморрагический цистит, пиелонефрит и «симптоматическую бактериурию». Однако этиологическую роль гарднерелл при этих заболеваниях трудно оценить, т.к. их часто выделяют из мочи клинически здоровых женщин, особенно из мочи беременных. Гарднереллёз мочеполовой системы у мужчин. Из мочеполового тракта мужчин бактерии выделяют редко, что объясняют действием неблагоприятных факторов, препятствующих колонизации. Известны случаи гарднереллёзных уретритов, особенно в ассоциации с другими патогенами, и они вносят вклад в общую заболеваемость негонорейными уретритами.

Диагностика основана на выявлении комплекса основных и вспомогательных критериев. Основные критерии. Наличие clue-клеток — эпителиальных клеток, покрытых большим количеством различно окрашивающихся по Граму бактерий (в отечественной практике — «ключевые» клетки), выявляемых в нативных мазках. На типичной «ключевой» клетке бактерии прикрепляются к её краю. Микроскопию проводят без иммерсии под большим увеличением; для гарднереллёза не типично наличие большого количества лейкоцитов в препаратах. Наличие аномальных аминов — продуктов симбиоза гарднерелл и влагалищных анаэробов в вагинальном отделяемом; больные отмечают постоянный или временный неприятный запах из половых органов, часто усиливающийся после половых контактов (семенная жидкость увеличивает рН, вызывая диссоциацию аминов). В лабораторных условиях для определения «рыбного» запаха к выделениям добавляют каплю 10% раствора КОН (соли аномальных аминов превращаются в летучие основания со специфическим запахом). Вспомогательные критерии. рН выделений 5,6-6,0 при практически полном отсутствии лактобацилл.  Отсутствие лейкоцитоза влагалищных выделений.