Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Диагностика гонореи у женщин. Окраска мазков по Граму не всегда даёт положительный результат. У молодых женщин с пиурией (более 10³ нейтрофилов в поле зрения при отсутствии прочей патогенной микрофлоры) необходимо исключить гонококковую этиологию заболевания. Для выделения культуры производят посев материала из шейки матки, уретры, влагалища, прямой кишки и глотки (Neisseria gonorrhoeae часто обнаруживают при бессимптомном носительстве в отделяемом из прямой кишки у женщин и мужчин-гомосексуалистов). Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме.

Серологические исследования не нашли широкого применения. Серотипирование штаммов возбудителя, выделенных у жертвы сексуального нападения и обвиняемого, используют в судебно-медицинской практике для доказательства имевшего место изнасилования. В диагностических целях иногда проводят реакцию Борде—Жангу (РСК) по стандартной схеме (бывает положительной с 3-4 недели болезни); в острых случаях реакция положительна у 35% больных, при хронических — у 65% (слабоположительная у 100%).

Род Pseudomonas

Представители рода Pseudomonas — прямые или изогнутые палочки; средние размеры 0,5-1,0x1,5-5,0 мкм. Аэробы, метаболизм строго дыхательного типа (терминальный акцептор электронов — 0₂), но некоторые виды используют нитраты в качестве альтернативных акцепторов электронов, что даёт им возможность расти в анаэробных условиях. Многие виды аккумулируют поли-р-гидроксибутират в качестве резервного источника углерода (в мазках выявляется в форме суданофильных включений). Хемоорганотрофы, некоторые виды - факультативные хемолитотрофы и используют Н₂ и СО₂ в качестве источников энергии. Подвижны (жгутики расположены полярно), исключая Pseudomonas mallei: спор не образуют. Большинство не нуждается во внесении факторов роста в среду. Большинство окисляет глюкозу и другие углеводы (несахаролитические виды не способны к их окислению), а также оксидаза-положительны. Многие виды свободноживущие либо считаются растительными и животными патогенами. Типовой вид — Pseudomonas aeruginosa. На основании гомологии РНК/ДНК виды Pseudomonas разделены на 5 гомологичных групп по структуре рибосомальной РНК и на несколько групп, имеющих гомологичную ДНК, соответственно предложено выделить из рода Pseudomonas некоторые микроорганизмы в роды Burkholderia, Stenolrophomonas и др. В данной главе микроорганизмы будут рассмотрены в соответствии с IX изданием определителя бактерий Берджи (1994).

Pseudomonas aeruginosa

 (синегнойная палочка) — основной возбудитель инфекционных поражений человека, вызываемых псевдомонадами; микроорганизм выделяют из кишечника 5% здоровых лиц и до 30% госпитализированных пациентов. Первое описание раневой инфекции, вызванной синегнойной палочкой, принадлежит Люке (1862), отметившему характерное сине-зелёное окрашивание перевязочного материала; в чистой культуре микроорганизм выделил Жессар (1882), изучивший его основные культуральные свойства. Первая вспышка госпитальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, зарегистрирована в 1897 г. (Багински), но уже в 1899 г. С.Н. Серковский указывал, что патогенные свойства микроорганизма чаще реализуются в организме лиц с ослабленным иммунитетом (детей и истощённых больных). Начиная с 70-х гг. Pseudomonas aeruginosa — один из основных возбудителей локальных и системных гнойно-воспалительных процессов, особенно в условиях стационаров. Более того, была показана патогенность синегнойной палочки для рыб, различных млекопитающих и даже растений.

Эпидемиология. Pseudomonas aeruginosa распространена повсеместно; её выделяют из почвы, воды, с растений и от животных (водных или обитающих в ареалах с повышенной влажностью); вода имеет существенное значение в циркуляции возбудителя, в ней он может выживать до года (при 37 °С), в том числе во многих растворах, применяемых в практической медицине, вплоть до жидкости для хранения контактных линз. Иногда входит в состав нормальной микрофлоры человека; у здоровых индивидуумов Pseudomonas aeruginosa выявляют на коже паха, подмышечных областей и ушей (до 2% лиц), на слизистой оболочке носа (до 3% лиц) и глотки (до 7%), в ЖКТ (3-24%). Поскольку возбудитель особенно обильно обсеменяет медицинское оборудование и циркулирует среди персонала и пациентов, то госпитализация существенно увеличивает колонизацию организма. Риск развития инфекции, вызванной синегнойной палочкой, существенно возрастает у больных с нарушениями барьерных систем и факторов резистентности. Инфицировании Pseudomonas aeruginosa вызывает до 15-20% всех внутрибольничных инфекций; считается одним из основных возбудителей нозокомиальных пневмоний (до 20%), вызывает треть всех поражений мочеполовой системы у урологических больных и считается причиной 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемии. В большинстве случаев источник инфекции и путь передачи обнаружить не удаётся, т.к. резервуарами возбудителя могут быть самые различные объекты (например, сырые овощи или букет цветов).

Часто синегнойную  инфекцию наблюдают у больных  с ожогами, заболеваниями мочевого пузыря, особенно у пациентов, длительно  получающих антибиотики, что обусловлено  выраженной устойчивостью возбудителя. Одним из важных факторов инфицирования пациентов считается нарушение правил стерилизации, хранения и применения мочевых и сосудистых катетеров, игл для поясничных пункций, оборудования для обеспечения дыхания больного, а также различных растворов. Высокий риск развития наблюдают как у лиц с иммунодефицитами (вызванными основной патологией), так и у лиц, длительно получающих цитостатики, глюкокортикоиды и антибиотики.

Морфология и тинкториальные свойства возбудителя. Средние размеры 1-3x0,5-1 мкм; в нативных препаратах подвижны (имеют один или два полярных жгутика). В мазках чистых культур расположены одиночно, парно либо в виде коротких цепочек; в мазках из патологического материала их чаще можно обнаружить в цитоплазме фагоцитов, при этом палочки могут быть деформированы; в клиническом материале полиморфизм отсутствует, а каких-либо включений не наблюдают. Синтезирует крахмалоподобное вещество типа внеклеточной слизи, покрывающее тонким слоем микробную клетку, но не формирующее морфологически очерченного слоя. Более вирулентные штаммы синтезируют повышенное его количество (мукоидные штаммы), что даёт основание рассматривать слизь как фактор патогенности. Наиболее часто мукоидные штаммы выделяют из мокроты больных муковис-цидозом и другими заболеваниями лёгких (например, при бронхоэктатической болезни). Формируя капсульное вещество в поражённом организме, клинические изоляты могут легко терять это свойство в первых лабораторных генерациях. Обычно фиксированные препараты окрашивают по Граму.

Культуральные свойства. Растёт в широком диапазоне температур (4-42 °С), что указывает на способность длительно сохраняться в окружающей среде и противостоять защитному повышению температуры тела. Отличительная особенность — ограниченная потребность в питательных веществах, обеспечивающая сохранение жизнеспособности в условиях почти полного отсутствия источников питания. При полном отсутствии углерода количество палочек и их ферментативная активность за неделю снижаются в 10-100 раз, при внесении минимальных количеств углеродсодержащих питательных веществ число палочек восстанавливается в короткие сроки. Pseudomonas aeruginosa хорошо растёт на простых питательных средах в аэробных условиях при температуре 30-37 °С, а также и при 42 °С (что можно использовать как дифференциально-диагностический признак). Образование слизи — характерная особенность; слизь придаёт характерную вязкость бульонным культурам и колониям мукоидных штаммов. На жидких средах (например, пептонная вода, МПЖ, бульон Хоттшгера) образует характерную серовато-серебристую плёнку; по мере старения культур возникает помутнение среды сверху вниз. На плотных средах (например, МПА, КА, среды Эндо, Левина, П.юскирева, ЦПХ-агар) образует весьма разнообразные колонии; на средах Эндо и Плоскирева обычно выделяют колонии следующих типов: плоские, неправильной формы, иногда склонные к слиянию, с волнистыми краями; напоминающие S-колонии Escherichia соli; складчатые с неровной поверхностью («маргаритки»); слизистые или мукоидные колонии; карликовые или точечные, формирующиеся к 18-24 ч роста при 37 °С. При росте на плотных средах у многих штаммов наблюдают феномен радужного лизиса, развивающийся спонтанно. Феномен характерен только для Pseudomonas aeruginosa, его можно рассматривать как таксономический признак. Более того, он индивидуально выражен у отдельных штаммов, и его можно использовать для внутривидовой дифференциальной диагностики. При образовании пигмента окрашивает некоторые среды, например агар Мюллера-Хинтона или МакКонки, в зелёный цвет.

Биохимические свойства. Pseudomonas aeruginosa — выраженный хемоорганот-роф; метаболизм дыхательный, никогда не бродильный; строгий аэроб. В качестве источника энергии синегнойная палочка использует Н₂ или СО. Универсальный акцептор электронов - молекулярный кислород. Как и большинство патогенных гноеродных микроорганизмов, каталаза-положительна. Подобно прочим аэробам, синтезирует цитохро-моксидазу (индофенолоксидаза), а оксидазный тест — один из ведущих при идентификации этой палочки. Синтезирует триметиламин, придающий культурам запах жасмина, винограда или карамели. Не нуждается в факторах роста. Способна расти на протяжении нескольких пассажей в чисто минеральной среде при добавлении подходящего единственного источника углерода. Ассимилирует ацетаты, пируваты, сукцинаты. Может утилизировать глюкозу, L-аланин при их содержании в среде не менее 0,5%. Не аккумулирует поли-β-окси-бутират в качестве внутриклеточного резерва углерода и не гидролизует поли-β-оксибутират внеклеточно. Продуцирует аргинин дигидролазу. Протеолитическая активность сильно выражена. Разжижает желатин, свёртыва-ет сыворотку крови, гидролизует казеин; утилизирует гемоглобин (большинство патогенных штаммов на кровяном агаре образует зону β-гемолиза). Синтезирует гиалуронидазу; гидролизует не только белки, но и отдельные аминокислоты (например, валин и аланин). Лизин и орнитин не декарбоксилирует; восстанавливает нитраты до нитритов и далее до молекулярного азота. Сахаролитическая активность низкая; окисляет только глюкозу с образованием глюконовой кислоты. Ввиду явного преобладания протеолитических свойств над сахаролитической активностью для идентификации синегнойной палочки среды Хисса для пёстрого ряда готовят с малым содержанием пептона (до 0,1%) и повышенной концентрацией углеводов (до 2%). При посеве можно наблюдать, помимо чёткой реакции с глюкозой, непостоянную ферментацию фруктозы и маннита. Тест Хью-Лейфсона положителен только с глюкозой (в аэробных условиях).

Пигментообразование — характерный и имеющий важное диагностическое значение признак (у 70-80% клинических изолятов). Среди пигментов наиболее часто встречают: Водорастворимый феназиновый пигмент пиоцианин, окрашивающий питательную среду, отделяемое ран и перевязочный материал в сине-зелёный цвет. В анаэробных условиях пигмент обычно бесцветный, но даже встряхивание среды (частичная аэрация) приводит к появлению окраски. Подавляющее большинство культур образует зелёный пигмент флюоресцеин, или пи-овездйн, флюоресцирующий при УФ-облучении (с длиной волны 254 нм); для обнаружения можно воспользоваться лампой Вуда. Некоторые штаммы могут синтезировать и другие пигменты — пиорубин (красный), пиомеланин (черно-коричневый), L оксифеназин (жёлтый). Оптимальная температура для синтеза пигментов in vitro 30-37 ⁰С. Кроме того, необходимо дополнение сред глицерином, аминокислотами (особенно аланином), ионами (особенно Mg²⁺ и К⁺). Высоковирулентные штаммы отличает значительное образование пиоциа-нина, проявляющего свойства бактериоцина, действующего на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также имеющего умеренную фунгицидную активность. При выделении культур иногда наблюдают атипичные непигментированные или слабопигментированные формы. Обычно их идентификация требует дополнительного тестирования, что усложняет диагностические исследования. Непигментированные штаммы составляют 8,3-18%, а 6-37% всех изолятов может быть пигментировано слабо.

  Клинические проявления. Для Pseudomonas aeruginosa нехарактерна высокая инвазив-ность; тем не менее её повсеместная распространённость (особенно в стационарах) делает её основным возбудителем раневых инфекций и осложнений при ряде состояний. Иногда поражения регистрируют и у лиц с нормальным иммунитетом (например, отиты наружного уха или синуситы у спортсменов-пловцов). Течение инфекций, особенно госпитальных, тяжёлое; выраженный фатальный характер носят септицемии, вызывающие гибель 35-75% пациентов.

Лабораторная диагностика. На наличие синегнойной инфекции может указать голубовато-зелёное окрашивание краев и отделяемого ран, перевязочного материала (особенно после обработки Н₂0₂), развитие синдрома ectyma gangrenosa (патогномоничного для синегнойных септицемии) при ожогах, поражениях мочеполовой системы. Косвенным показателем может служить щелочная среда (обычно кислая). Однако следует учитывать, что большинство случаев поражений внутренних органов диагностируют выделением возбудителя (рис. 8). Для успешного проведения анализа важное значение имеет способ взятия исследуемого материала. Техника взятия и первичного посева клинического материала аналогична таковой при лабораторной диагностике возбудителей других бактериальных кишечных и гнойно-воспалительных инфекций. Однако при взятии материала для исследования следует соблюдать и учитывать следующие важные моменты. Исследуемый материал желательно забирать до начала терапии антибактериальными препаратами или (если она начата) только после выведения препарата из организма. Материал для бактериологического исследования следует забирать непосредственно из очага поражения с соблюдением всех необходимых правил асептики. При невозможности взятия материала непосредственно из очага инфекции или если он сообщается с внешней средой проводят исследование отделяемого (например, мочи при пиелонефритах, мокроты при пневмониях, отделяемого цервикального канала или влагалища при воспалениях половых органов и др.).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia

повсеместно распространённый микроорганизм, экология и эпидемиология которого имеют  много общего с таковыми у Pseudomonas aeruginosa, но проявляющий меньшую вирулентность. Часто контаминирует препараты для местной анестезии слизистой оболочки верхних отделов дыхательных путей, растворы, применяемые при бронхоскопии, а также различные лекарства (включая антибиотики), используемые ингаляционно. Наиболее часто инфекции наблюдают у больных муковисцидозом. Pseudomonas cepacia — подвижная полиморфная палочка, снабжённая 3-8 полярно расположенными жгутиками (лофотрихи). Окисляет глюкозу, лактозу, мальтозу и маннит; резистентна к полимиксину В. По Грому часто окрашивается биполярно. Выделение требует применения селективных сред; температурный оптимум 30 °С (некоторые штаммы могут расти при 35 °С); на кровяном агаре с полимик-сином В образует выпуклые мутные маслянистые беловато-серые колонии. Некоторые штаммы синтезируют метиламин, придающий культурам сладковатый запах; также возможно образование жёлтого или зеленоватого нефлюоресцирующего феназинового пигмента, растворимого в воде и хлороформе.

Pseudomonas (Burkholderia) mallei

возбудитель сапа — инфекционного заболевания человека и животных; заболевание известно с древнейших времён (ещё Аристотель считал сап заразной болезнью). Возможность заражения человека от животных впервые описал Оскандес (1783). Возбудитель выделили Лёффлер, Шютц (1882) и Н.П. Васильев (1883).

Эпидемиология. Возбудитель неустойчив к действию факторов внешней среды; прямой солнечный свет убивает его за 24 ч, но в выделениях больных может сохраняться на свету в течение нескольких недель. Термолабилен — при 100 ⁰С погибает в течение нескольких минут, при 55-60 °С — за 1-2 ч. В воде сохраняется до ЗО сут. Помещения, в которых находились больные животные, представляют эпидемическую опасность в течение 6 нед. Преимущественно болеют чувствительные животные — лошади, ослы, верблюды, реже — козы, собаки и кошки. Среди лабораторных животных к возбудителю чувствительны хомячки и морские свинки. Заболевание человека носит выраженный профессиональный характер; основной путь заражения — контактный (при попадании возбудителя на повреждённую кожу и слизистую оболочку конъюнктивы). Также реальную опасность представляет использование заражённой воды. Довольно часто отмечают случаи лабораторных инфекций, при которых нельзя исключить воздушно-капельное заражение. Благодаря проведённым интенсивным профилактическим мероприятиям в настоящее время сап не представляет серьёзной эпидемической угрозы. Отмечают лишь спорадические случаи в Азии, Африке, Центральной и Южной Америке.

Морфология и тинкториальные свойства. Тонкие, слегка изогнутые палочки с закруглёнными концами размером 2-3x0,5-1 мкм; при выращивании in vitro склонны к полиморфизму (образуют более мелкие формы либо цепочки); неподвижны; спор не образуют. Окрашиваются анилиновыми красителями (часто окрашиваются биполярно).