Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Эпидемиология. Актиномицеты входят в состав нормальной анаэробной микрофлоры ротовой полости, ЖКТ и влагалища (реже). Обладают, особенно Actinomyces israelii, выраженной адгезивной активностью на слизистых оболочках и способностью к быстрой колонизации. Актиномикозы регистрируют практически во всех странах мира; больные составляют до 2,5-10% всех пациентов с хроническими гнойными процессами различной локализации; мужчины болеют почти в 2 раза чаще, чем женщины. Наибольшее число случаев регистрируют в осенне-зимний сезон, что связано с ростом частоты простудных заболеваний, обусловливающих благоприятный фон для развития актиномикозов.

Морфология и культуральные  свойства возбудителя. Actinomyces israelii склонен образовывать длинный ветвящийся мицелий (средние размеры нитей 3-10x0,6 мкм), со временем распадающийся на полиморфные (кокковидные, колбовидные и др.) элементы. На простых средах растёт плохо, лучше — на белковых средах, дополненных сывороткой; образует прозрачные бесцветные пастообразные, обычно гладкие колонии, плотно срастающиеся со средой; воздушный мицелий скудный; пигментов не образует; на некоторых средах (например, на кровяном агаре) может формировать белые бугристые колонии, напоминающие коренные зубы. Actinomyces odontolyticus на кровяном агаре образует красные колонии, окружённые зоной (β-гемолиза. Все актиномицеты растут медленно, и посевы следует культивировать в течение 7-14 сут (особенно при подозрении на инфекцию Actinomyces israelii).

Клинические проявления. Инкубационный период варьирует от нескольких суток до многих лет; клиническую картину актиномикозов определяют их локализация, период развития поражений и их характер (локальный, распространённый либо диссеминированный). Наиболее частое поражение — актиномикоз лица, наблюдаемый у 55-60% всех больных актиномикозами и у 6-10% лиц, страдающих воспалительными поражениями челюстей и лица. Заболевание протекает хронически, но часто осложняется присоединением вторичных бактериальных инфекций; возможны поражения кожи, мышц, лимфатических узлов, языка, слюнных желёз и костных тканей. Сравнительно редкие поражения — актиномикоз мочеполовой системы (наиболее часто связывают с применением внутриматочных контрацептивов).

Лабораторная диагностика. Несмотря на отсутствие особых сложностей, адекватное распознавание актиномикоза остаётся непростой задачей, что во многом обусловлено неинформированностью клиницистов о его частоте. Наиболее распространённый метод лабораторной диагностики — обнаружение друз Actinomyces israelii в экссудате или гнойном отделяемом из очагов поражения; последние, иначе обозначаемые как серные гранулы (тельца Бомингера) размером в среднем 0,3-2 мм. Они образованы агрегатами мицелия, имеющими вид округлых или овальных базофильных масс с эозинофильными структурами на поверхности. Иногда в мазках можно обнаружить чёткообразные атипичные формы Actinomyces israelii, a A. meyeri представлен мелкими неветвящимися клетками. Веское подтверждение диагноза — выделение и идентификация возбудителя.

Анаэробные грамположительные кокки

В медицинской  практике обычно выделяют бактерии родов Peptostreptococcus (P. magnus, P. asaccharolyticus, P. prevotii, P. anaerobius, P. micros) и Peptococcus (с монотипным видом P. niger). Микроорганизмы растут в анаэробных и микроаэрофильных условиях (5-10% CO₂, образуя большое количество молочной кислоты. Прочие грамположительные кокки родов Ruminococcus. Coprococcus, Gemella и Sarcina большого медицинского значения не имеют. А. Род Peptococcus образуют неподвижные сферические клетки размером 0,3-1,2 мкм; в мазках располагаются парами, тетрадами, беспорядочными скоплениями или короткими цепочками. Хемоорганотрофы, нуждаются в обогащённых питательных средах. Инертны к углеводам, энергию получают расщеплением пептона. Обычно каталаза-отрицательны; индол не образуют; нитраты не восстанавливают. На кровяном агаре некоторые штаммы формируют чёрные колонии. Температурный оптимум 37 ⁰С. Облигатные паразиты слизистых оболочек. Типовой вид — Peptococcus niger. Род Peptostreptococcus образуют неподвижные кокки и коккобациллы размером 0,5-1,2 мкм; морфология и физиология сходны с таковыми у представителей рода Peptococcus; некоторые виды выделяют индол и восстанавливают нитраты. Типовой вид — Peptostreptococcus anaerobius.

Инфекционность. Анаэробные кокки входят в состав микробных сообществ полости рта, верхних отделов дыхательных путей, толстой кишки и влагалища. В практической бактериологии они составляют вторую (по частоте выявляемости) группу анаэробов (после бактероидов). Инфекции, вызываемые анаэробными кокками, носят эндогенный характер; при этом практически ничего не известно об их вирулентных и патогенных свойствах; вполне возможно, что они обусловлены наличием капсулы, действием ЛПС, гиалуронидазы и коллагеназы. Как правило, они не способны вызывать моноинфекции, но их часто выделяют в составе ассоциатов при плевропневмониях, внутрибрюшинных абсцессах, гинекологических поражениях (эндометриты, абсцессы бартолиниевых желёз, послеродовой сепсис и др.), инфекциях кожи и мягких тканей (включая некротизирующие фасциты, гангренозные процессы и инфекции трофических поражений у больных сахарным диабетом), а также при остеомиелитах.

Лабораторная диагностика включает микроскопию клинического материала (гнойное отделяемое, кровь, аспираты суставных жидкостей и костей) и выделение возбудителя. В мазках, окрашенных по Грому, очень напоминают стафилококки. Клетки Peptostreptococcus anaerobius чаще выглядят как коккобациллы, образующие короткие цепочки, a Peptostreptococcus tetradius — тетрады. Peptostreptococcus magnus представлен крупными (более 0,7 мкм) клетками, располагающимися одиночно или бесформенными массами; напротив, клетки Peptostreptococcus micros мелкие и образуют короткие цепочки. На кровяном агаре колонии грамположительных анаэробных кокков мелкие, выпуклые, блестящие, прозрачные или мутные, появляются через 48 ч. Колонии Peptostreptococcus anaerobius несколько крупнее, мутные, имеют характерный сладковатый запах; чувствительны к действию анетолсульфоната натрия (что используют для дифференциальной диагностики методом дисков); штаммы Peptococcus niger довольно часто образуют чёрные колонии.

Род Neisseria

  Род Neisseria образуют сферические, формирующие пары или скопления бактерий размером 0,6-1,0 мкм; исключением считают Neisseria elongata, образующую короткие, 0,5 мкм, палочки (диплобациллы и короткие цепочки). Благодаря делению в двух плоскостях некоторые виды образуют тетрады. Неподвижны, некоторые виды имеют капсулу и микроворсинки. Отношение к окраске по Грому может варьировать, но по строению и составу клеточная стенка не имеет существенных отличий от оболочек других грамотрицательных бактерий. Аэробы или факультативные анаэробы, каталаза- (исключая Neisseria elongata), цитохромоксидаза- и окси-даза-положительны, некоторые образуют жёлтые каротиноидные пигменты. Большинство видов неприхотливо, но некоторые непосредственно после посева приобретают сложные пищевые потребности для роста (позднее растут на простых средах определённого состава), отдельные виды проявляют гемолитическую активность. Восстанавливают нитраты (кроме Neisseria gonorrhoeae и Neisseria canis). Хемоорганотрофы. Температурный оптимум 35-37 °С. Величины оптимума рН у различных штаммов варьируют, но для большинства находятся в пределах 6,0-8,0. Обитатели слизистых оболочек млекопитающих; типовой вид — Neisseria gonorrhoeae. Патогенными для человека являются Neisseria gonorrhoeae (гонококк) и N. meningitidis (менингококк). Непатогенные виды, выделяемые у человека, — Neisseria sicca, N.flavescens, N. perflava, N. mucosa и N. lactamica, микроорганизмы считают комменсалами, поэтому на ранних этапах выявления они иногда могут быть ошибочно приняты за патогенные виды.

 Микроскопия наиболее часто позволяет выявить диплококки, напоминающие кофейные зёрна или бобы, прилегающие друг к другу несколько уплощёнными сторонами (рис. 9-1). Характерные пары наблюдают при любом расположении кокков в культурах (короткие цепочки, тетрады, гроздья). У большинства свежевыделенных штаммов Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis присутствует капсула; у бактерий также обнаруживают пили и микроворсинки, облегчающие адгезию патогенных видов к эпителию. Пили препятствуют эффективному внутриклеточному уничтожению гонококков после поглощения их нейтрофилами. Помимо пилей, нейссерии обладают поверхностным белковым комплексом, что облегчает их адгезию к поверхности эпителия. In vivo количество и строение поверхностных структур варьируют под действием различных факторов.

Метаболическая активность. Патогенные нейссерии не растут на обычных питательных средах, но хорошо культивируются на средах, содержащих цельную кровь, сыворотку, асцити-ческую жидкость. Непатогенные виды менее прихотливы. Наличие цитохромоксидазной активности особенно важно для первого этапа дифференцировки различных видов рода. Большинство свежевыделенных штаммов Neisseria gonorrhoeae для роста нуждается в присутствии 4-10% СО₂, в атмосфере, при дальнейшем культивировании это свойство может утрачиваться. Каждый вид избирательно ферментирует углеводы, конечный продукт — уксусная кислота. Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis способны также расщеплять глюкозу по окислительному пути Энтнера-Дударова и через пентозофосфатный шунт. В метаболизме  патогенных видов задействован цикл трикарбоновых кислот, заканчивающийся образованием молекул АТФ и соединений-предшественников различных биосинтетических реакций; их количество в значительной степени зависит от условий культивирования. Рост Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis стимулируют внесение гемолизированной крови и крахмала в питательную среду и повышенное содержание СО₂. Наличие в среде свободных жирных кислот ингибирует рост, их действие инактивируют внесением крахмала, сыворотки или древесного угля. Температурный оптимум для роста 36-39 °С, патогенные виды могут расти в интервале температур 24-41 °С, а непатогенные способны к росту при температурах ниже 24 °С, что часто используют для дифференцировки непатогенных видов. Коммерческие питательные среды для выделения клинически значимых видов Neisseria составлены с учётом метаболической активности бактерий; наиболее широко применяют среды, содержащие сыворотку. Можно использовать кровяной и шоколадный агары с добавлением крахмала; существенное значение имеют повышенные концентрации СО₂ и внесение в среду компонентов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры.

Neisseria gonorrhoeae

Возбудитель гонореи — инфекционного венерического заболевания с воспалительными проявлениями в мочеполовых путях; открыл Найссер в 1879г. Первые культуры получили Лейапков и Лёффлер (1882), этиологическую роль доказал Бумм (1885). Термин «гонорея» ввел Гален во II веке н.э., хотя заболевание известно очень давно; во всяком случае, в вавилонских, ассирийских и греческих мифах упоминается болезнь, являющаяся, судя по клинической картине, гонореей. В настоящее время гонорею относят к наиболее распространённым инфекционным заболеваниям. Основной путь заражения — половой, возможно инфицирование плода при прохождении через родовые пути матери; также отмечены казуистические случаи заражения при несоблюдении элементарных правил личной гигиены. Субстраты для колонизации — эпителий мочеиспускательного канала, прямой кишки, конъюнктивы, глотки, шейки матки, маточной трубы и яичника. Гонококковая инфекция часто проявляется воспалением тазовых органов и бесплодием у женщин. Диссеминирование возбудителя может приводить к пельвиоперитониту, менингитам, артритам, эндокардитам и септицемиям. В свежих культурах возбудители представлены неподвижными аспорогенными диплококками (средний размер клетки 1,25-1,0x0,7-0,8 мкм), образующими капсулу. Характерен полиморфизм - встречаются более мелкие или более крупные клетки, а также палочковидные формы. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями (метиленовым синим, бриллиантовым зелёным и др.), цитоплазма имеет осмиофильные включения. Для выявления тинкториальных свойств применяют окраску по Граму с нейтральным красным. Образуют L-формы, в том числе и под действием пенициллина; под влиянием химиопрепаратов быстро меняют свойства и образуют грамположительные формы. Выделено более 30 ауксотипов.

Культуральные свойства. Аэробы и хемоорганотрофы; для роста требуют свежеприготовленных влажных питательных сред с добавлением нативных белков крови (например, агар Маклёода), сыворотки или асцитической жидкости; оптимум рН 7,2-7,4, температуры 37 ⁰С. Биохимические свойства не считают строго постоянными. Типичные гонококки разлагают только глюкозу с образованием кислоты, изменённые формы иногда не ферментируют ни одного углевода, имеют каталазу и цитохромоксидазу. Протеолитических свойств не имеют, аммиака, сероводорода и индола не образуют, не вызывают гемолиза на средах, содержащих кровь; на средах с добавлением молока, желатина и картофеля не растут. Во внешней среде неустойчивы, поэтому посев следует проводить сразу после забора материала от больного. Через 24 ч на твёрдых питательных средах гонококки, содержащие в клеточной стенке протеин II, образуют слегка мутные бесцветные колонии; бактерии, не содержащие протеин II, образуют круглые прозрачные колонии в виде капель росы (диаметром 1-3 мм) с ровными краями. На основании результатов РСК и РА выделяют 4 типа бактерий (некоторые авторы выделяют 3 или 5 типов), не имеющих больших биохимических различий, но отличающихся типом роста, что коррелирует с их вирулентностью. Гонококки, образующие мелкие колонии типов Р⁺ и Р⁺⁺ (ранее называемые Т1 и Т2), снабжены пилями и более вирулентны, чем микроорганизмы из крупных колоний Р~ (ранее — типы ТЗ и Т4), лишённые пилей. При длительном культивировании могут образовывать дочерние колонии. На жидких питательных средах растут диффузно и образуют поверхностную плёнку, через несколько дней оседающую на дно. Экзотоксины не продуцируют, клеточная стенка содержит токсичную субстанцию (эндотоксин) липополисаха-ридной природы, теряющую свои свойства при нагревании до 100 °С. На твёрдых средах свежевыделенные бактерии из колоний типов Р⁺ и Р⁺⁺ окружены капсулой; при пересевах на селективные среды их вирулентность может возрастать. Длительное культивирование на неселективных средах может приводить к снижению вирулентности штаммов, потере пилей и увеличению размеров колоний (т.е. к переходу в бактерии типа Р⁺).

В патогенезе диссеминирования гонококковой инфекции существенное значение имеет пол больного, обусловливающий характер развивающихся системных синдромов (например, воспаления тазовых органов, артритов, септицемии, менингитов и др.). Женщины более склонны к диссеминированным поражениям. Заболевание часто протекает бессимптомно, поэтому лечения не проводят, что делает женщин основными носителями инфекции. У мужчин бессимптомное течение гонореи наблюдают редко. После перенесённого заболевания иммунитет к вторичным заражениям не вырабатывается, врождённая невосприимчивость отсутствует, возможны супер- и реинфекции. Единственный чувствительный организм — человек; животные резистентны к гонококкам, и лишь внутрибрюшинное их введение вызывает гибель мелких лабораторных животных. До настоящего времени неясно, в какой степени инфекция стимулирует местные иммунные реакции и почему AT, определяемые в сыворотке крови больного (агглютинины, преципитины, опсонины и комплемент-связывающие тела), не обеспечивают защиту от повторного заболевания. Как указывалось выше, фагоцитарные реакции при гонорее носят незавершённый характер.

 Культуры Neisseria gonorrhoeae из отделяемого уретры часто устойчивы к бактерицидному действию сыворотки пациента. Культивирование на питательных средах приводит к потере устойчивости, восстанавливаемой воспроизведением условий среды уретры больного. Вирулентные типы наиболее резистентны к бактерицидному воздействию сыворотки и при совместной инкубации приобретают абсолютную устойчивость.

Диссеминирование  гонококковой инфекции индуцирует образование  AT, функции которых остаются невыясненными. Вследствие высокой антигенной изменчивости гонококков вакцина, на которую возлагали столько надежд, оказалась неэффективной. В настоящее время её применяют для лечения больных с осложнениями или в диагностических целях (провокационные пробы).

 Лабораторная диагностика. При типичной форме острого гонорейного уретрита распознавание возбудителя в условиях лаборатории не представляет особого труда и может быть ограничено бактериоскопическим исследованием мазков гнойного отделяемого. Для этого готовят два мазка: первый окрашивают 1% спиртовым раствором эозина и 1% водным раствором мети-ленового синего, второй мазок окрашивают по Граму. Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме. Имеются определённые различия в проведении бактериологической диагностики и выделении возбудителя у мужчин и женщин.

Диагностика гонореи у мужчин. Для бактериоскопии материал размазывают тонким слоем на предметных стёклах. Бактериоскопическая диагностика основана на наличии 3 признаков — характерной морфологии, внутриклеточного расположения бактерий и окраски по Граму. Критерием правильной окраски считают наличие недообесцвеченных участков в местах большой толщины мазков. При окраске по Граму мазков отделяемого из уретры обычно обнаруживают грамотрицательные парные кокки, расположенные внутриклеточно (характерный признак гонореи). В исследуемом материале могут оказаться грамотрицательные кокки рода Veillonella, напоминающие гонококки. Результаты зависят от соблюдения правил забора материала из передней уретры и простаты. Для этого рекомендуют за 2-3 сут прекратить применение дезинфицирующих и антибактериальных препаратов, воздерживаться от мочеиспускания в течение 4-6 ч и провести туалет окружающих кожных покровов. Забор материала должен проводить лечащий врач. Материал засевают на твёрдые питательные среды - асцит-агар, среду с аутолизатами и сывороткой, кровяной агар (свежеприготовленные и влажные). Инкубацию посевов желательно проводить при повышенном содержании С0₂(10-20%). Гонококки — прихотливые микроорганизмы, чувствительные к незначительным колебаниям температуры (в пределах 0,5 °С). При невозможности проведения культуральных исследований на месте забора материала можно провести посев ватным тампоном на транспортные среды (например, среду Стюарта), сохраняющие жизнеспособность гонококков. Засеянные пробирки пересылают в бактериологическую лабораторию, где проводят полный анализ. В зависимости от условий культивирования и качества среды колонии появляются через 1-8 сут после посева. Характерная особенность — аутолиз колоний от центра к периферии, начинающийся уже через сутки. Характерный признак Neisseria gonorrhoeae — оксидаза-положительные колонии грамотрицательных диплококков, что при соответствующих клинических признаках позволяет диагностировать гонорею. Изменение окраски колоний происходит в течение нескольких секунд с варьированием от розовой до чёрной; гонококки окрашиваются даже в случаях расположения под колониями других микроорганизмов. Подтверждают диагноз результаты определения ферментативного расщепления глюкозы, но не мальтозы и сахарозы. К наиболее специфичным и быстрым способам идентификации следует отнести иммунофлюоресцентные методы с использованием флюоресцирующей антисыворотки и окрашиванием акридиновым оранжевым. У мужчин-гомосексуалистов материал для посева и бактериоскопии необходимо забирать также из ротовой полости, глотки и прямой кишки.