Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Эпидемиология. Микроорганизм широко распространён в окружающей среде; его выделяют из воды, почвы и сточных вод; часто обитает в кишечнике людей и животных; Clostridium perfringens также способна вегетировать в почве, богатой гумусом. Наиболее часто в почве и испражнениях обнаруживают серотип А. Место постоянного обитания представителей серотипа С, ответственных за пищевые токсикоинфекции у человека, пока не установлено; возбудителей выделяют из мясных и рыбных консервов и органов людей, умерших от «некротического энтерита». У человека Clostridium perfringens вызывает два типа поражений — газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.

Морфология и культуральные  свойства возбудителя. Вегетативные клетки — крупные, строго грамположительные; жгутиков не имеют, неподвижны (один из немногих неподвижных видов). Классические формы представлены короткими палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0x1-1,5 мкм). Морфология может варьировать (антибиотики, ионы металлов, радиоактивное облучение); например, in vitro на углеводных безбелковых средах могут образовывать коккоба-циллярные формы, а на белковых безуглеводных средах — нити с заострёнными концами. In vivo образуют капсулы (единственный капсулообразующий вид среди патогенных клостридий). В течение некоторого времени капсулы сохраняются и при культивировании на средах, содержащих нативный белок; наиболее выражены у вирулентных штаммов, резистентных к фагоцитарным реакциям. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями; в старых культурах могут быть грамотрицательными. Споры Clostridium perfringens крупные, овальные, расположены центрально (у С. perfringens типа А — также субтерминально); клетка-спорангий практически не деформируется. Термоустойчивость спор серотипов В и D относительно невысока (погибают при кипячении в течение 15-30 мин), споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении и даже автоклавировании в течение 1-6 ч. Спорообразование обычно имеет место в почве и кишечнике; in vitro споры можно получить на щелочных средах, богатых белком и не содержащих сбраживаемых углеводов (например, на свернувшейся лошадиной сыворотке). Спорообразование стимулирует прогревание при 75 "С в течение 10-15 мин. Тип A. Clostridium perfringens типа А — факультативный анаэроб (в сравнении с другими клостридиями) и относительно толерантен к кратковременным кислородным воздействиям, хотя имеются чувствительные штаммы, погибающие при воздействии О, на культуру в течение 3 мин. Способен расти в высоких столбиках сред без герметизации вазелином.

Морфология колоний Clostridium perfringens типа А значительно варьирует от условий выращивания: на плотных питательных средах обычно образуются S- и R-колонии. 5-коло-нии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями; в начале роста прозрачные, напоминающие капли росы, позднее становятся мутными, серовато-белыми. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты. У некоторых штаммов отмечают слизистые М-колонии, особенно у слизистых вариантов С. perfringens типа А, образующих густую слизь на жидких средах; напоминают S-колонии с более высоким куполом и слизистой консистенцией; представлены капсулированными клетками. Иногда можно наблюдать смешанные 0-колонии. На агаре Цейсслера через 12-18 ч образует гладкие сероватые колонии с ровными краями и плотным возвышением в центре. Колонии окружены зоной гемолиза; он может быть полным либо частичным. Зона гемолиза может быть двойной: вокруг колоний полный гемолиз (за счёт действия гемолизинов), на отдалении — неполный (за счёт действия лецитиназы). При контакте с кислородом колонии могут приобретать зеленоватую окраску. На желточном агаре образует колонии, окружённые зоной перламутрового преципитата (фосфорилхолин), образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы. Характерный признак колоний Clostridium perfringens типа А — способность менять Серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в аэробных условиях (может служить дифференциально-диагностическим признаком). Колонии в толще питательной среды имеют вид чечевичных зёрен, дисков или комочков ваты. Рост на жидких и полужидких средах, особенно содержащих глюкозу, происходит очень бурно с образованием Н₂ и С0₂ и обычно заканчивается через 8-12 ч; при стоянии среда постепенно светлеет и образуется обильный осадок; культуры Clostridium perfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. Первые признаки роста на среде Китта-Тарроци могут проявляться уже через 1-2 ч (особенно при 43 °С); последние проявляются появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании. Помутнение среды и активное газообразование можно наблюдать через 4-8 ч культивирования.

 Метаболическая активность. Clostridium perfringens расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, маннозу, крахмал, гликоген и инозит; глицерин разлагают не все штаммы; не сбраживает маннит, дульцит; редко ферментирует салицин и инсулин. От прочих клостридий С. perfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая; разжижает желатин, не разлагает казеин; только некоторые штаммы медленно разжижают свернувшуюся сыворотку. Интенсивно створаживают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка уже через 3 ч (феномен известен как «штормовая реакция»).

 Патогенность. Для человека патогенны Clostridium perfringens типов А, С и D; типы В, С, D и Е вызывают аналогичные заболевания у сельскохозяйственных животных.

Лабораторная диагностика. Необходимо чётко идентифицировать роль Clostridium perfringens в развитии тех или иных клинических состояний, т.к. микроорганизм часто входит в состав нормальной микрофлоры кишечника и его содержание может достигать 10³ микробных тел или 10 спор в 1 г фекалий здорового человека. Выделение проводят по общепринятой схеме. При смешанных инфекциях можно прогреть исследуемый материал и выделить Clostridium perfringens из термоустойчивых спор, внесённых в питательную среду, с последующим развёрнутым анализом.

Идентификация микроорганизма осуществляется набором стандартных тестов — подвижность, серологические реакции и др.; Clostridium perfringens также можно идентифицировать по росту на яичном агаре: колонии С. perfringens окружены опалесцирующим белым «преципитатом», появляющимся под действием α-токсина (лецитиназы С); образование зон преципитации можно ингибировать, наслоив на половину чашки специфическую антисыворотку одновременно с посевом тест-культуры.

Прочие  возбудители анаэробной раневой  инфекции.

Помимо Clostridium perfringens и Clostridium novyi, газовую гангрену у человека и животных могут вызывать и другие клостридий. Исторически многообразие форм анаэробных поражений привело к тому, что к началу первой мировой войны имелось 71 наименование, обозначающее анаэробную инфекцию, за время войны их дополнили 20 названий, а к концу войны — ещё 16. В 1861 г. Пастер описал «септический вибрион», а со времени выделения культуры совместно с Жубером (1977) Vibrion septique длительное время оставался единственным идентифицированным патогенным микробом, с действием которого связывали многие заболевания. Дальнейшая история открытия возбудителей анаэробных инфекций включает выделение сапрофитов С. putrificus (Биншток, 1883) и Clostridium sporogenes (И.И. Мечников, 1908), а в 1915 г. М.В. Вейнберг и Сэгэн выделяют C.fallax, «бациллу злокачественного отёка» Clostridium oedematiens (1915) и «тканерасплавляющую» бациллу Clostridium histolyticum (1917). Характерная особенность микроорганизмов — способность проявлять патогенное свойство в условиях смешанных раневых инфекций. Все они грамполо-жительные анаэробы (но некоторые относительно толерантны к О₂), образуют споры, форма которых варьирует от круглой до цилиндрической. Принцип выделения возбудителей напоминает таковой при выделении культуры С. perfringens.

Clostridium histolyticum.

Подвижная палочка (также встречают неподвижные  изоляты) размером 3-5x0,5-0,8 мкм; грамположительна, но в старых культурах может быть грамотрицательной. В мазках часто образует пары или цепочки. Очень подвижна в молодых культурах, клетки из старых культур неподвижны (также известны изначально неподвижные штаммы). Почти на всех средах быстро образует субтерминальные споры с трёхслойной оболочкой, не деформирующие клетку. Строгий анаэроб, растёт при давлении 3-15 мм. рт.ст. (оптимум 8 мм рт.ст.), но обладает аэротолерантностью, оставаясь жизнеспособной в аэробных условиях в течение 10ч. В аэробных условиях растёт плохо и не образует спор. В анаэробных условиях на кровяном агаре образует прозрачные выпуклые колонии диаметром 0,5-1 мм, окружённые тонкой зоной гемолиза. При продолжительном отборе можно получить штаммы, формирующие колонии в виде головы Медузы. В толще агара неподвижные штаммы образуют «пушинки» с уплотнённым центром, подвижные — чечевицеобразные колонии или колонии с протуберанцем. Вызывают сплошное помутнение жидких сред с протеолизом кусочков мяса и печени на дне. Через 2 сут среда становится прозрачной, а на дне образуется осадок. рН почти не меняется; запах отсутствует. Инертны к углеводам (к ферментации без образования кислоты способны лишь некоторые штаммы); не образуют индол, но вырабатывают в больших количествах сероводород. Проявляют выраженные протеолитические свойства — разлагают желатин, свернувшуюся сыворотку, яичный белок и коллаген. Продуцируют 5 серологически идентифицируемых токсинов: а-токсин (основной токсин), оказывающий летальное и некротическое действие; р-токсин (коллагеназа), расщепляющий азоколл и желатин; γ-токсин (протеиназа), активируемый восстановителями и не разрушающий нативный коллаген, но расщепляющий азоколл, желатин и казеин; β-токсин (эластаза), проявляющий аналогичную активность; е-токсин, проявляющий 0₂-зависимую гемолитическую активность (лабилен к кислороду, в антигенном отношении близок к стрептолизину О). У человека Clostridium histolyiicum иногда вызывает газовую гангрену, обычно в ассоциации с прочими анаэробами.

Clostridium septicum

(палочка Гона—Сакса). Полиморфные подвижные палочки размером 4-5x0,8 мкм; в тканях способны образовывать нити длиной до 500 мкм. В культурах клетки могут быть яйцевидные, веретеновидные, образуют цепочки. При контакте с 0₂ теряют подвижность, но не так быстро, как С. oedematiens. Через 24 ч культивирования образуют субтерминальные споры. Строгие анаэробы; растут при давлении 8-15 мм рт.ст. (выдерживают до 25 мм рт.ст.). Остаются жизнеспособными при доступе О₂ в течение 10 ч. На поверхности твёрдых сред образуют блестящие полупрозрачные колонии, (диаметром до 4 мм) с неровными краями (имеют тенденцию к ползучему росту). На агаре Цейсслера через 48 ч палочки образуют сплошной нежный налёт, окружённый зоной гемолиза. В столбике 1% агара формируют колонии с отходящими переплетающимися нитями, на 2% агаре колонии имеют вид дисков, иногда с протуберанцем. Ферментируют некоторые углеводы и не разлагают (практически все штаммы) сахарозу (что используют для дифференциальной диагностики с С. Chavoei), протеолитическая активность выражена умеренно. На среде Китта—Тароцци даёт обильный рост; газообразование вариабельное; через 2 сут образует осадок. Продуцируется 4 экзотоксина: α-токсин, проявляющий летальную, некротизирующую и гемолитическую активность; р-токсин, обладающий свойствами ДНК-азы; γ-токсин (гиалуронидаза); Палочки Гона-Сакса (совместно с другой анаэробной микрофлорой) вызывают газовую гангрену у человека и животных.

Clostridium chavoei

возбудитель «шумящего карбункула» крупного рогатого скота. По своим биологическим и антигенным свойствам мало отличается от Clostridium septicum, некоторые авторы рассматривают его как подвид С. septicum: С. septicum тип А и С. chavoei тип В. Однако каждый из этих микроорганизмов полностью нейтрализует только гомологичная сыворотка, а при дифференциальной диагностики этих микроорганизмов необходимо учитывать отсутствие полной перекрёстной нейтрализации токсинов, слабую терморезис-тентность у С. septicum и высокую у С. chavoei, длительный инкубационный период при инфекции, вызванной первым микроорганизмом, и практически полное его отсутствие при заболеваниях, вызванных С. chavoei, способность С. septicum агглютинировать эритроциты барана и лизировать эритроциты кур. Молоко створаживает за 3-6 сут; казеин и свернувшуюся сыворотку не разжижает; желатин не гидролйзует. На среде Цейсслера образует характерные колонии, напоминающие виноградные листья, нежного фиолетового цвета; на средах с кровью даёт α-гемолиз. На среде Китта-Тароцци характерен обильный рост, споры образует через 24 ч, колонии не имеют неприятного запаха.

 Clostridium sporogenes

 подвижные палочки размером 3-6x0,5 мкм; проявляют выраженные протеолитические свойства и биохимически инертны в отношении большинства углеводов. При смешанных анаэробных инфекциях увеличивают вирулентность Clostridium perfringens и Clostridium septicum, при попадании жизнеспособных спор в мышцы способны вызывать гнойные процессы. Палочка не образует токсинов, участвующих в патогенезе анаэробной раневой инфекции.

   Clostridium sordellii

 выделена Сордеми от больного газовой гангреной в Буэнос-Айресе (1922). Подвижная палочка размером 2-4x0,6-1 мкм; факультативный анаэроб; на плотных питательных средах уже через 24-48 ч образует выпуклые сероватые колонии с неровными краями. На агаре с эритроцитами лошади даёт узкую зону гемолиза, а на шоколадном агаре образует узкую зону просветления (за счёт протеолиза). На агаре с куриным желтком, молоком и лактозой формирует зону опалесценции вокруг колоний. На жидких мясных средах даёт интенсивный рост, часто с образованием слизи. Ферментирует многие углеводы, но не лактозу и сахарозу, проявляет выраженные протеолитические свойства. Вирулентные штаммы продуцируют высоколетальный некротизирующий токсин, напоминающий а-токсин Clostridium novyii также образует лецитиназу С, серологически сходную с лецитиназой С. perfringens типа А, но проявляющую меньшую активность;

Clostridium fallax

впервые выделена Прево из почвы тропических районов Африки. Подвижная прямая палочка с закруглёнными концами, 2-5x0,5 мкм; строгий анаэроб; на поверхности агара через 24-48 ч образует мелкие плоские прозрачные колонии с неровными краями; на кровяном агаре даёт узкую полоску гемолиза. Ферментирует углеводы; проявляет умеренную протеолитическую активность, свёртывают молоко с образованием кислоты. Не образует H,S, индола и не восстанавливает нитраты. По мнению ряда авторов, способна вырабатывать летальный токсин, серологически не идентифицированный до настоящего времени.

Clostridium bifermentans.

По морфологии и биохимическим свойствам похожа на Clostridium sordellii, дифференциальная диагностика основана на серологической идентификации агглютининов спор; образует лецитиназу С. Иногда вызывает газовую гангрену у человека; вместе с Clostridium novyi, С. septicum, С. histolyticum и С. perfringens типа А (продуцирующими а-токсин) относят к так называемым гистотоксическим клостридиям. Неподвижная палочка размером 4-8x1-1,5 мкм, в молодом возрасте грамположительная; в мазках располагается цепочками. Быстро образует центральные или субтерминальные споры, не деформирующие клетку. На агаре Цейсслера обусловливает нежный рост, напоминающий рост С. oedematiens. На средах с кровью даёт α-гемолиз; проявляет лецитиназную активность (лецитиназа С). Разжижает свернувшуюся сыворотку, гидролизует желатин, ферментирует глюкозу, левулёзу и мальтозу. На среде Kumma-Тароцци газ не образуется, через 24 ч культивирования появляется осадок. Рост сопровождается гнилостным запахом.

Род Actinomyces

Длительное  время актиномицеты классифицировали как грибы, однако изучение их морфологии и биологических свойств позволило отнести их к шизомицетам, т.е. бактериям. В отличие от грибов, актиномицеты не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы, а сама она аналогична таковой у бактерий; не обладают способностью к фотосинтезу; образуемый ими мицелий достаточно примитивен. Они размножаются только бесполым путём. С бактериями актиномицеты объединяют отсутствие чётко выраженного ядра, чувствительность к бактериофагам и антибиотикам (при резистентности к противогрибковым средствам), а также способность к хорошему росту в слабощелочной (но не кислой) среде. Род образуют тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,2-1,0x2,5 мкм; часто образуют нити длиной до 10-50 мкм. Характерная особенность актиномицетов — способность образовывать хорошо развитый мицелий, у одних видов он длинный, редко ветвящийся, у других короткий и сильно ветвящийся; его нити не имеют перегородок (истинный мицелий). Палочковидные формы, часто с утолщёнными концами, в мазках располагаются одиночно, парами, V- или Y-образно либо в виде палисада. Все морфологические формы способны к истинному ветвлению, особенно на тиогликолевой полужидкой среде. Окраску по Грамму удерживают плохо; часто образуют зернистые либо чёткообразные формы; конидий не образуют; кислотонеустойчивы. Факультативные аэробы и анаэробы; для хорошего роста как в аэробных, так и анаэробных условиях нуждаются в повышенном содержании СО₂. Хемоорганотрофы; ферментируют углеводы с образованием кислоты без газа; продукты ферментации — уксусная, муравьиная, молочная и янтарная кислоты (но не пропионовая). Синтез каталазы и способность к восстановлению нитратов варьируют у разных видов; индол не образуют, некоторые дают α-гемолиз на средах с кровью. Некоторые виды формируют нитчатые микроколонии, напоминающие мицелий; на 7-14 сут образуют видимые крошковатые S-колонии, иногда окрашенные в жёлтый или красный цвет. Оптимум температуры 35-37 °С; Преимущественно обитают в ротовой полости и на поверхности слизистых оболочек у млекопитающих, в том числе и человека; некоторые виды — почвенные сапрофиты; типовой вид — Actinomyces bovis. Б. Поскольку актиномицеты входят в состав микрофлоры полости рта и ЖКТ, то их следует рассматривать как условно-патогенные микроорганизмы, их способность вызывать специфические поражения соответственно не выражена. Заболевания, вызываемые ими, обозначают термином «актиномикозы»; впервые их детально изучил Бомингер (1877) при поражениях крупного рогатого скота; первое описание поражений у человека привёл Израэль (1878). Актиномикоз у людей отмечают редко; подавляющее большинство случаев вызывает A. Israel», и лишь в редких случаях выделяют A. naeslundii, A. odontolyticus, A. bovis и A. viscosus. Внутривидовая дифференциальная диагностика актиномицетов основана на различиях в способности ферментировать углеводы и некоторых других биохимических тестах.