Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Семейство Mycobacteriaceae

Род Mycobacterium

Mycobacterium tuberculosis (палочка Коха)

 Возбудитель туберкулёза человека — хронического инфекционного заболевания, характеризующегося поражениями органов дыхания, костей, суставов, кожи, мочеполовых и некоторых других органов. Заболевание известно с глубокой древности. Лёгочная форма туберкулёза описана античными авторами (Аретеем Каппадокийским, Гиппократом и др.). Однако древние авторы не рассматривали его как инфекцию, а Ибн-Сина вообще считал его наследственной болезнью. Первым прямо указал на его инфекционную природу Фракасторо, а Сильвий отметил связь лёгочных бугорков с чахоткой. Многообразие клинических проявлений туберкулёза (или, как его называли, чахотки) обусловило много ошибочных, представлений; де Лаэннёк относил лёгочные бугорки к злокачественным новообразованиям, и даже великий Biipxoe не связывал казеозный некроз с туберкулёзным процессом. Рост городов, скученность населения и низкий санитарный уровень жизни привели к тому, что в XVIII-XIX вв. туберкулёз собирал обильную жатву среди разных слоев населения: достаточно вспомнить Моцарта, Шопена, Некрасова, Чехова и др.; более того, «чахоточный вид» даже вошёл в моду, и дамы затягивались в корсеты, пили уксус «для томной бледности» и закапывали белладонну в глаза «для лихорадочного блеска». Инфекционная природа заболевания была впервые доказана Вильменом (1865), а важнейшим этапом в изучении и совершенствовании мер борьбы с туберкулёзом стало короткое сообщение Коха на заседании Берлинского физиологического общества 24 марта 1882 г. об этиологии туберкулёза, в котором он изложил основные постулаты-критерии для оценки патогенности любого микроорганизма.

Эпидемиология. Резервуар Mycobacterium tuberculosis — больной человек; основной путь заражения — аэрогенный, реже через кожу и слизистые оболочки. В редких случаях возможно трансплацентарное инфицирование плода. Проникновение микобактерий далеко не всегда вызывает развитие патологического процесса; особую роль играют неблагоприятные условия жизни и трудовой деятельности. Наблюдаемое в настоящее время в РФ прогрессирование заболеваемости связано, с одной стороны, с очевидным снижением уровня жизни населения и сопутствующим дисбалансом в питании, многочисленными стрессами и наплывом беженцев из других республик бывшего СССР; с другой стороны, усиливается «активность» возбудителя, обусловленная, очевидно, вытеснением естественных конкурентов в результате применения антимикробных средств. Во всяком случае, в благополучных странах (например, США) заболеваемость с 1985 по 1992 гг. возросла на 20%; во всех странах ежегодно регистрируют 8-10 млн случаев инфицирования. В некоторых странах Африки, Азии и Океании заболеваемость достигает 300 больных на 100000 человек. Не меньшее значение имеют «старение» населения во всём мире и увеличение количества лиц с хроническими заболеваниями, сопровождающимися нарушениями иммунитета. Особую роль в инфицировании Mycobacterium tuberculosis играет скученность населения; в РФ — следственные изоляторы, лагеря беженцев, лица «без определённого места жительства» и т.д. В США наибольшую заболеваемость регистрируют в Чикаго и Вашингтоне; всего — более 20 000 случаев ежегодно.

Морфология и тинкториальные свойства. Тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки размерами 1-10x0,2-0,6 мкм, со слегка закруглёнными концами; в цитоплазме содержат зернистые образования (2-10). Морфология существенно варьирует в зависимости от возраста культуры и условий культивирования — в молодых культурах палочки более длинные, а в старых склонны к простому ветвлению. Иногда образуют кокковидные структуры и L формы, сохраняющие инфекционность, а также фильтрующиеся формы, патогенетическая роль которых остаётся плохо изученной. Неподвижны, спор не образуют, лишены капсул, но имеют микрокапсулу, отделённую от клеточной стенки осмиефобной зоной. Кислотоустойчивы, что обусловлено высоким содержанием липидов и миколовой кислоты в клеточной стенке, а также образуют кислотолабильные гранулы, преимущественно состоящие из метафосфата (зёрна Муха), располагающиеся свободно либо в цитоплазме палочек. Грамположительны, анилиновые красители воспринимают плохо; по Цилю-Нильсену окрашиваются в ярко-красный цвет, по Муху-Вайссу — в фиолетовый (йодофильность); гранулы также окрашиваются в соответствующий цвет.

Культуральные свойства. Аэробы, но способны расти в факультативно анаэробных условиях; 5-10% содержание С0₂ способствует более быстрому росту. Размножаются делением, процесс проходит очень медленно, в среднем за 14-18 ч. Температурный оптимум 37-38 "С; рН 7,0-7,2 (растёт в пределах 4,5-8,0). Для роста нуждаются в присутствии белкового субстрата и глице (биотина, никотине щивания наиболее раньяни, Дорсё и среда Сотона) и д той плёнки (R-фор средах, содержащи при периодически хорошо выявляете щий сближение ба ных кос и имеюш отмечают на 14-4 приподнятым цент водой и имеют npt нии трещат. Под ванием мягких влг ний. Отличителы-значительного кол ренциальной диап вий — необходим^ вый зелёный (т.к. жёлчью образуют палочками.

Патогенез поражений  и клинические проявления. Наиболее часто заражение происходит посредством ингаляции аэрозоля, содержащего микобактерии, либо при употреблении контаминированных продуктов (не следует забывать о возможности проникновения возбудителя через кожу и слизистые оболочки). В более редких случаях, у ослабленных подростков и взрослых, а также у пациентов с иммунодефицитами, наблюдают диссеминированный (милиарный) туберкулёз, характеризующийся образованием гранулём в различных органах. Развитие генерализованных поражений наиболее часто происходит после прорыва содержимого гранулёмы в кровоток. Общие проявления аналогичны таковым при вторичном туберкулёзе, но к ним часто присоединяются поражения мозга и его оболочек; прогноз подобной формы заболевания неблагоприятный. Многообразие форм туберкулёзного процесса обусловило сложность его классификации. В настоящее время клиническая классификация выделяет три основные формы:

Туберкулёзная интоксикация у детей  и подростков. Туберкулёз других органов и систем, включая поражения мозговых оболочек; глаз; суставов и костей; кишечника и брюшины; кожи и подкожной клетчатки (папулонекротический туберкулид Бека); органов мочеполовой системы и др. При постановке клинического диагноза учитывают также локализацию, протяжённость и фазу процесса, а также способность к активному выделению микобактерий.

Лабораторная диагностика включает методы, входящие в обязательный диагностический минимум, и дополнительные методы исследования. Первые включают, помимо физикального и рентгенологического исследования, следующие манипуляции: В случае заболевания микроскопия патологического материала (мокрота, отделяемое свищей, моча, промывные воды из бронхов) в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсе-ну, может выявить красные кислотоустойчивые палочки; в последние годы в практику внедрён метод Мурахаси-Йошиды (1957), позволяющий дифференцировать мёртвые и живые бактерии. Однако бактериоскопический метод наименее чувствителен, т.к. позволяет выявить возбудитель при содержании 100 000-500 000 микобактерий в 1 мл материала. При незначительном содержании возбудителя можно использовать метод накопления по Уленгуту — материал смешивают с равным или двойным объёмом смеси NaCI и NaOH, энергично встряхивают и инкубируют 30 мин при температуре 21 "С. Затем клеточный детрит и посторонние бактерии (в виде супернатанта), разрушившиеся под действием щёлочи, удаляют центрифугированием; осадок нейтрализуют 30% раствором уксусной кислоты и готовят мазки, окрашиваемые по Цилю—Нильсену или Киньону. Более эффективен метод флотации — в материал вносят раствор NaOH, дистиллят и ксилол (бензол) и энергично длительно встряхивают; образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерий; её отсасывают и готовят мазки Определённую ценность в оценке тяжести процесса, эффективности лечения и прогноза заболевания имеет количественная оценка популяции микобактерий методом Гаффки-Стинкена (подсчёт бактерий на калиброванных стёклах в определённых полях зрения). Наиболее результативный бактериоскопический метод — люминесцентная микроскопия, т.к. окраска флюорохромом (например, аурамин-родамином) позволяет выявлять даже незначительное количество микобактерий (окрашиваются в бело-жёлтый цвет), а также формы с изменёнными культуральными и тинкториальными свойствами. Выделение возбудителя. Перед посевом исследуемый материал можно обработать по Уленгуту или Сумиоши (15-20% раствором НСl или H₂S0₄); исследуемые образцы центрифугируют, отмывают физиологическим раствором и засевают, тщательно втирая, на твёрдые питательные среды (обычно Лёвенштайна-Йемена). Для простоты можно обработать образцы различными антибиотиками, подавляющими рост контаминирующей флоры. Недостаток метода — длительность получения результата от 2 до 12 нед. Достоинство — возможность получения чистой культуры, что позволяет её идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувствительность к лекарственным препаратам. Разработаны ускоренные методы выделения возбудителя (например, Прайса); материал помещают на предметное стекло, обрабатывают H₂S0₄, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной кровью. Стекло вынимают через 3-4 сут и окрашивают по Цилю—Нильсену. «Золотой стандарт» в диагностике туберкулёза — биологическая проба на морских свинках, заражённых подкожно или внутрибрюшинно 1 мл материала, полученного от больного. У животных развивается генерализованная инфекция, приводящая к смерти через 1-2 мес; однако заболевание можно распознать раньше постановкой проб с туберкулином  — через 3-4 нед после заражения, а лимфадениты обнаруживают уже на 5-10 сут. Пунктаты последних содержат значительное количество микобактерий.  Появление в последние годы резистентных (особенно изониазид-устойчивых) или изменённых микобактерий снизило чувствительность биологической пробы. Для её повышения применяют интратестикулярное заражение либо подавляют иммунитет организма животных введением глюкокортикоидов. Серологические исследования. Предложено большое количество различных реакций, выявляющих Аг микобактерий и AT к ним, например РСК, РА, РПГА по Бойдену, агрега-тагглютинации и др.; однако они либо не обладают необходимой специфичностью, либо требуют дифференциальной диагностики при получении ложноположительных реакций с Аг и AT к другим микобактериям. Кожные пробы с туберкулином имеют особую значимость, т.к. позволяют проводить широкомасштабные скрининговые обследования населения; метод включает внесение небольших доз (обычно 5 ЕД) ППД-Л (новый туберкулин Коха) в кожные насечки (реакция Пирке), внутрикожно (реакция Манту) и подкожно (реакция Коха). При положительном результате через 48 ч (у пожилых лиц — через 72 ч) в месте введения формируется папула диаметром 10 мм с гиперемированными краями. В большинстве стран наиболее распространена проба Манту, т.к. результаты реакции Пирке часто вызывают затруднения при их интерпретации. Положительная реакция Манту указывает на контакт лица с Аг Mycobacterium tuberculosis или других бактерий, дающих перекрёстную реакцию; положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса. При появлении папулы меньших размеров (5-10 мм) результат считают сомнительным, и рекомендовано повторить пробу с введением 10 ЕД. При ещё меньших размерах папулы реакцию считают отрицательной; следует помнить, что отрицательная реакция Манту не всегда указывает на отсутствие процесса, т.к. у больных с иммунодефицитами и анергией реакция обычно также отрицательна. Дополнительные лабораторные методы включают оценку иммунного статуса пациента, что имеет прогностическое значение, т.к. у больных с дефектами Т-лимфоцитов прогноз хуже.

Mycobacterium leprae.

Возбудитель проказы (лепры или болезни Хансена) — хронической генерализованной инфекции с преимущественным поражением производных эктодермы (покровные ткани и периферическая нервная система). Проказа — одна из древнейших инфекций, известных человечеству; она упоминается в китайских трактатах 3000-летней давности, а в Индии (судя по упоминаниям в Ригведе) оно было известно ещё в VII в. до н.э. Распространению заболевания способствовали развитие мореплавания и торговли, а также завоевательные походы; в античном мире это были финикияне (отсюда morbusphoenicicus) и греки (elephantiasis graecorum)', в Европу проказу занесли легионы Рима, где заболеваемость достигла пика в XI-XIII вв., откуда болезнь проникла в Новый Свет (XV-XVI вв.), Австралию и Океанию (начало XIX в.). В большинстве стран заболевание проказой приравнивалось к гражданской смерти с исключением из общества и лишением наследства; больных либо убивали, либо изгоняли в пустынные места. Само библейское zaraath (проказа) было собирательным термином, обозначающим моральную и физическую нечистоту. Для изоляции больных ещё в Византии были организованы ксенодбхии, где призревали прокажённых; в средневековье их сменили лепрозории, порядки которых скорее напоминали тюрьмы, а побег всегда карался смертью. Однако эти драконовские методы дали свои плоды. Начиная с XIV в. заболеваемость в Европе резко снизилась, и сейчас проказа встречается в нескольких странах в виде небольших очагов. В настоящее время в мире насчитывают около 2 млн больных, преимущественно в странах Третьего мира. Возбудитель открыт норвежским врачом Хансеном (1873) и Найссером (1874).

Морфология и тинкториальные свойства. Размеры палочек Хансена-Найссера варьируют в пределах 1-8x0,2-0,5 мкм (в свежих поражениях крупнее); их форма прямая или изогнутая, концы могут быть заострёнными или утолщёнными; они неподвижны, спор не образуют; облигатные внутриклеточные паразиты. В мазках располагаются параллельными группами («пачки сигар») или шаровидными скоплениями до 200 мкм, окружёнными полупрозрачной неокрашивающейся массой. В некоторых клетках можно обнаружить дегенеративные зернистые включения; делящиеся особи имеют поперечную, не окрашиваемую по Цилю-Нильсену полоску. Клеточная стенка трёхслойная; помимо миколовой кислоты в ней содержится лепрозиновая оксикислота (С₈₈Н₁₇₄0₆). Кислото- и спиртоустойчивы (свойство теряется при длительном хранении препаратов в формалине); хорошо окрашиваются по Цилю—Нильсену, Эрлиху и различными анилиновыми красителями; грамположительны, сохраняют окраску генциановым фиолетовым при обесцвечивании. Несмотря на то, что палочки проказы сохраняют свою морфологию и тинкториальные свойства (в трупах до нескольких лет), их жизнеспособность вне организма человека быстро теряется.

Культуральные свойства. Mycobacterium leprae выращивают на глицериново-картофель-ном и кровяном агарах, яичных средах; наибольшее распространение получили агар, дополненный сывороткой человека, и среда Вассерманна. Культуры развиваются медленно; рост наблюдают через 6-8 нед в виде сухого морщинистого налёта. Попытки вызвать экспериментальное заражение различных животных (включая приматов) обычно не имеют успеха; с переменным успехом предпринимались многочисленные заражения мышей, особенно японских «пляшущих», в подушечки лап с последующим развитием гранулём. В 1974 г. появилось интересное сообщение Стбррса с соавторами в журнале «Science» о воспроизведении заболевания у девятипоясных броненосцев-армадиллов (Dasypus novemcinctus), у 40% заражённых животных через 15 мес развивалась диссеминированная проказа; более того, содержание возбудителя в лепроматозных тканях было в 100 раз и более выше, чем в эквивалентном количестве тканей человека. К настоящему времени установлена возможность естественного инфицирования броненосцев (зарегистрировано в Техасе и Луизиане) и обезьян мангобеев (Cerocebus).

Эпидемиология проказы остаётся до конца не изученной; заболевание мало контагиозно, что делает невозможным выявить в каждом конкретном случае путь заражения и источник инфекции. Единственный резервуар — больной человек; заражение происходит при непосредственных контактах, а также воздушно-капельным путём. Доказана возможность внутриутробного заражения, но дети, отделённые от больных родителей после рождения, не заболевают. Основным способом борьбы с проказой остаётся изоляция больного; опыт отдельных стран, например Норвегии и Исландии, показывает, что пациента вовсе не обязательно помещать в лепрозорий, а достаточно соблюдения элементарных санитарно-гигиенических норм (принципы профилактики заложены Хансеном). Ведущая роль в распространении принадлежит социально-экономическим факторам, о чём свидетельствует более высокая заболеваемость в странах Третьего мира; иногда она может принимать эпидемический характер и протекать очень тяжело, как это наблюдалось в Науру (Новая Каледония).

Клинические проявления. Инкубационный период заболевания длится необычайно долго — 4-6 лет, но нередко затягивается до 10-15 лет и более. Продромальные явления — лихорадка, слабость, потеря аппетита и боли в костях — часто могут отсутствовать. Клинически выделяют пять форм заболевания: полярную туберкулоидную, пограничную туберкулоидную, недифференцированную, пограничную лепроматозную и полярную лепроматозную. Туберкулоидная форма характеризуется разрастаниями грануляционной ткани в коже и слизистых оболочках. Часто наблюдают один очаг (иногда единственное проявление болезни), иногда — кожные высыпания недифференцированной формы. При полярной туберкулоидной форме число очагов поражений не превышает 1-3, они обычно симметричны и характеризуются выраженной анестезией. При пограничной туберкулоидной форме число очагов значительно больше, они асимметричны, анестезия выражена несколько меньше; часто наблюдают невриты локтевого, срединного, лицевого, ушного и других нервов. Недифференцированная форма проявляется кожными высыпаниями и поражениями периферических нервных стволов; может трансформироваться в лепроматозный или туберкулоидный тип. Высыпания представляют чётко ограниченные пятна (леприды) разной окраски и размера; после короткого периода гиперестезии становятся анесте-тичными. Моно- и полиневриты часто сопровождаются неравномерными утолщениями нервных стволов. Лепроматозная форма. Поражения локализуются преимущественно на лице и дистальных отделах конечностей в виде сплошных инфильтратов, имеющих красновато-бурую окраску; у больных часто наблюдают выпадение бровей и ресниц, а узлы и инфильтраты часто придают лицу своеобразное выражение, известное как «львиное лицо» (fades leonina). Также характерны поражения глаз в виде лимбитов, кератосклеритов, иридоциклитов и увеитов, приводящие к ослаблению зрения и слепоте. Лимфатические узлы, особенно бедренные, паховые и локтевые, часто увеличены в объёме и содержат значительное количество возбудителя. Нередко отмечают лепроматозные периоститы и оститы, приводящие к остеопорозам и остеомаляциям. Иногда отмечают гепатоспленоме-галию. Анестезии гранулём обычно не наблюдают, они могут сохраняться многие годы, рассасываться или подвергаться рубцовым изменениям.