Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Лабораторная диагностика. Обнаружение Mycobacteriuth leprae делает диагноз несомненным и помогает определить тип заболевания . Материал получают соскобом (энергичным) слизистой оболочки носовой перегородки, выделением тканевого сока (после 2-3 мм надреза поражённых тканей) или пункцией увеличенных лимфатических узлов. Мазки окрашивают по Цилю—Нильсену; обращают внимание на любые кислотоупорные бактерии; при сомнительных результатах можно поставить биологическую пробу на морских свинках (чувствительны к Mycobacterium tuberculosis и резистентны к Mycobacterium leprae}. Для дифференциальной диагностики туберкулоидной формы применяют кожную пробу с аллергеном М. leprae (лепроминовая проба), всегда отрицательную при лепроматозной форме (что обусловлено отсутствием клеточных иммунных реакций).

М. kansasii.

Образуют  пигмент (кристаллы β-каротина) только при росте на свету; в некоторых случаях могут быть скотохромогенными (распознают по обилию пигментных кристаллов) или непигментированными. По степени шероховатости колоний штаммы варьируют от SR до RS, но могут быть полностью шероховатыми (R). Для идентификации кристаллов каротина рекомендовано изучение колоний под малым увеличением (30-100); их наличие — чёткий признак, отделяющий М. kansasii (а также М. marinum) от других видов. У человека вызывает туберкулёзоподобные поражения лёгких; наиболее часто наблюдают шейные лимфадениты (так называемые скрофулы) и поражения кожи; реже, особенно у ослабленных пациентов, — диссеминированные поражения. Природный резервуар заболевания остаётся неизвестным; вполне вероятно, что им окажется больное животное (на что указывает частое выделение возбудителей из молочных продуктов); в РФ заболеваемость относительно невысокая, тогда как в США существуют целые регионы (Иллинойс, Оклахома, Техас), где возбудитель явно доминирует среди прочих микобактерии. Диагностика включает выделение и идентификацию возбудителя по основным признакам; следует помнить, что AT к М. kansasii перекрёстно реагируют с Аг Mycobacterium tuberculosis, и у инфицированных лиц отмечают положительную реакцию Манту.

М. marinum (М. balnei)

  чаще образуют S-колонии; отличительная особенность — ускоренный рост при температуре 30-33 'С и полное его отсутствие при 37-40 ⁰С. Следует помнить, что скорость роста у различных штаммов варьирует от 5 до 15 сут. До 30% штаммов дают слабо положительный ниациновый тест. У человека наиболее часто вызывает кожные поражения верхних и нижних конечностей, аналогичные таковым при инфицировании М. ulcerans, но последние более характерны для тропических регионов. М. marinum — возбудитель туберкулёза рыб; широко распространён в солёных и пресноводных водоёмах. Возбудитель часто изолируют со стенок плавательных бассейнов и берегов естественных водоёмов. Типичное поражение — инфицирование ран конечностей, полученных при ударе о стенку бассейна или любой объект на дне и берегах водоёма. Чаще наблюдают образование изъязвляющейся гранулёмы, спонтанно ограничивающейся в течение нескольких недель, в более редких случаях формируется хроническая инфекция.

М. ulcerans.

 По культуральным и биохимическим свойствам напоминает М. marinum; у человека вызывает хронические поражения кожи, наиболее часто регистрируемые в Новой Гвинее, Африке и Северной Австралии. Поражения характеризуются вовлечением в гранулематозное воспаление как кожи, так и подкожной клетчатки, также известные как язва Бурули (впервые описана Куком в 1897); при отсутствии адекватного лечения процесс быстро прогрессирует.

Семейство Mycoplasmatacea

М. hominis

входит в  группу урогенитальных микоплазм, также  включающую М. genitalium, М. fermentans и М. primatum (чаще выделяют у обезьян и редко у человека).

Эпидемиология. Основной путь передачи возбудителя — половой; частота выявления коррелирует с половой активностью и достигает максимума у проституток, наркоманов и гомосексуалистов. Некоторые авторы полагают, что к заражению микоплазмами предрасполагает приём пероральных контрацептивов, а также половые контакты в определённые фазы менструального цикла. Распространённость. В разных странах показатели инфицированности варьируют в пределах 10-50%. Получению более полной информации препятствуют бессимптомное носительство М. hominis и наличие AT у клинически здоровых лиц.

Культуральные свойства. Микроорганизм хорошо растёт на средах, используемых для культивирования прочих микоплазм; при выделении из клинического материала в питательные среды вносят 0,02% аргинина, индикатор (феноловый красный) и вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры, — пенициллин (100 ЕД/мл) и полимиксин В (500 ЕД/мл) или ацетат таллия (в конечной концентрации 1:2000). Несмотря на большую вариабельность размеров колоний М. hominis, морфологически они не отличаются от колоний прочих микоплазм. М. hominis неподвижна, не проявляет гемадсорбционных и гемолитических свойств.

Клинические проявления. М. hominis преимущественно инфицирует органы мочеполовой системы, вызывая деструктивно-воспалительные процессы с выраженными микроцирку-ляторными нарушениями. Поражения мочеполовой системы, обусловленные микоплазмами, достаточно распространены (например, М. hominis выделяют в 13-70% случаев негонококкового уретрита); возбудитель также выделяют при патологии мочевыводящих путей (28-65%), особенно при пиелонефритах, циститах и гломерулонефритах. Реже возбудитель выделяют из синовиальной жидкости при синдроме Райтера, ревматоидных и ювенильных артритах; при этом нередки ассоциированные поражения совместно с М. arthritidis, M. fermentans и уреаплазмами. У мужчин возбудитель преимущественно колонизирует уретру и крайнюю плоть; основные поражения — уретриты и простатиты; очевидно, что поражения предстательной железы вторичны и, по данным разных авторов, у 10-80% подобных больных была выделена М. hominis, а при склерозе простаты возбудитель выделяли у 41% пациентов. Некоторые авторы прямо связывают инфекцию М. hominis с развитием простатитов. У женщин М. hominis колонизирует влагалище (вызывая бактериальные вагинозы), реже шейку матки и уретру; возбудитель вызывает уретриты, цервициты и воспалительные поражения тазовых органов (сальпингиты, оофориты, эндометриты, аднек-ситы, параовариальные абсцессы); М. hominis выделяют у 50% подобных больных, при этом у 25% отмечают 4-кратное увеличение титров сывороточных AT, что свидетельствует об их непосредственном участии в развитии патологических процессов. М. hominis выделяют и от клинически здоровых женщин; очевидно, существуют определённые пороговые количественные величины, при достижении которых проявляется повреждающее действие. Однако в настоящее время они остаются неизвестными. Некоторые авторы связывают воспалительные процессы органов малого таза, вызванные М. hominis (особенно 7 серовара), с нарушениями фертильных функций. Особую опасность представляет урогенитальный микоплазмоз беременных, т.к. он может стать причиной привычного невынашивания беременности, преждевременных родов, внутриутробного заражения плода и привести к развитию послеродового сепсиса. В частности, после инфекционных абортов у 50-60% женщин выделяют М. hominis, a у 40-50% отмечают достоверное увеличение титров сывороточных AT. В настоящее время обсуждают связь инфекций, вызванных М. hominis, с абортами, мертворожде-ниями и синдромом задержки внутриутробного'развития; при этом выделение возбудителя от беременных увеличивается в 1,5-2 раза по сравнению с небеременными. Одна из причин прерывания беременности на ранних сроках — способность М. hominis колонизировать эндометрий и плодное яйцо и индуцировать синтез простагландинов и других арахидонатов. Инфицирование на более поздних сроках сопровождается формированием очага инфекции в околоплодных водах с последующими поражением базальной пластины и отторжением плода. В ряде случаев после накопления микоплазм в околоплодных водах возможно заражение плаценты и пупочного канатика, что приводит к инфицированию плода через систему кровоснабжения. Высокую частоту пороков развития (особенно ЦНС) связывают со способностью микоплазм вызывать необратимые поражения хромосомного аппарата клеток, а также их проникновением через гематоэнцефалитический барьер. В некоторых случаях возможно интранатальвое заражение плода; в подобных ситуациях входными воротами становятся слизистые оболочки глаз, ротовой полости, половых органов и воздухоносных путей новорождённых.

 Лабораторная диагностика. Для выявления М. hominis обычно используют РП, реакцию ингибирования роста и РИФ; для обнаружения сывороточных AT наиболее пригодны РПГА и бактерицидный сывороточный тест. В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи разработан удобный метод идентификации Аг в реакции агрегатгемагглютинации.

Род Ureaplasma

Род включает патогенный для человека вид — Ureaplasma urealyticum, впервые выделенный в 1954 г. от больного уретритом (Шёпард); первоначально возбудитель называли Т-микоплазма-ми или Т-штаммами из-за мелких (англ, tiny) колоний, не превышающих 10-30 мкм. Наиболее часто Ureaplasma urealyticum вызывает поражения мочеполовой системы, но нередко микроорганизмы выделяют при различных артритах.

Морфология. В настоящее время выделяют 3 основных типа микроорганизмов: мелкие (120-150 нм) с гомогенной цитоплазмой, включающей значительное количество рибосом; средние (500-750 нм), характеризующиеся периферическим расположением рибосом; крупные с негомогенной цитоплазмой и выраженным генофором.

Культуральные свойства. Особенность уреаплазм — способность к быстрому росту в оптимальных условиях; логарифмическая фаза роста укорочена и через 16-18 ч переходит в стационарную. Температурный оптимум 36,5-37 °С, оптимум рН 6,5-7,0; при незначительном защелачивании среды клетки быстро погибают. На жидких питательных средах растут скудно; для культивирования используют среды, содержащие гидролизат бычьего сердца, гидролизат казеина, пекарские дрожжи и красители — кристаллический фиолетовый и бромтимоловый синий. Среды дополняют внесением 10% лошадиной сыворотки, 0,05% мочевины, 2% L-цистеина и антибиотиков (обычно пенициллина). Размножение возбудителя (даже при совместном росте с М. hominis) приводит к изменению окраски среды с лимонно-жёлтой на синюю; осадка обычно не образуют; появление осадка может быть обусловлено избытком клинического материала (особенно у женщин) либо ростом контаминирующей пенициллинрезистентной микрофлоры. Рост уреаплазм ингибируют ионы NH₄⁺, накапливающиеся в погибших клетках; внесение новых порций среды мало влияет на жизнеспособность микроорганизмов; жизнеспособность клеток в жидких культурах не превышает 3-5 сут. Растут на твёрдых средах, используемых для культивирования микоплазм; в среды следует добавлять 0,01 М мочевины (концентрацию можно повышать до 1,5%), но не вносить ацетат таллия, т.к. он ингибирует их рост. Для роста нуждаются в создании газовой среды, включающей 5% СО₂ и 95% N, либо 5% О₂ 10% С0₂ и 85% N₂.

Биохимические свойства. Уреаплазмы инертны к сахарам, не восстанавливают диазо-красители, каталаза-отрицательны; проявляют (5-гемолитическую активность к эритроцитам кролика и морской свинки; продуцируют гипоксантин. Уреаплазмы секретируют фосфо-липазы; протеазы, селективно действующие на молекулы IgA и уреазу. Отличительная особенность метаболизма — способность продуцировать насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.

Эпидемиология. Распространённость. Результаты многочисленных исследований, направленных на выявление Ureaplasma urealyticum у больных и клинически здоровых лиц, показывают на инфицированность 25-80% лиц, ведущих активную половую жизнь и имеющих трёх и более партнёров. Микроорганизм редко выделяют у детей и подростков, а также пожилых женщин. Основной путь передачи — половой, на основании чего уреаплазмы включают в группу инфекций, передающихся половым путём. Основной резервуар — больные лица. Основные группы риска — проститутки, гомосексуалисты и наркоманы; уреаплазмы значительно чаще выявляют у больных гонореей, трихомониазом, кандидозом. Семейство включает один род Chlamydia, представленный сфероидальными организмами 0,2-1,5 мкм в диаметре; грамотрицательны, клеточные оболочки сходны по строению со стенками грамотрицательных бактерий, но лишены пептидогликанов; хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе и Хименесу; их можно выявить темнопольной микроскопией неокрашенных препаратов. Вне клеток хозяина метаболические функции сведены до минимума и трудны для выявления; при наличии соответствующих кофакторов способны катаболи-зировать глюкозу, пировиноградную или глутаминовую кислоты, синтезировать некоторые липиды и выделять С0₂ Хламидии неспособны синтезировать высокоэнергетические соединения и обеспечивать собственные энергетические потребности («энергетические паразиты»). Клетки сохраняют морфологическую сущность на всём протяжении жизненного цикла, способны к вегетативному делению, содержат РНК и ДНК. Размножаются бинарным делением и не являются представителями нормальной микрофлоры человека; способны образовывать L формы (спонтанно или под воздействием индукторов) и самопроизвольно возвращаться к исходным формам. Геном очень маленький, составляет не более 15% размера генома кишечной палочки; представлен кольцевой молекулой ДНК (М_г 360 000-500 000 кД) и кодирует синтез не более 500 белков. Многообразие поражений, вызываемых хламидиями, и трудности их идентификации обусловили существовавшую до недавнего времени таксономическую путаницу; в частности, М.П. Чумаков (1935) предложил называть их провацёкии, АЛШаткин (1966) — гальпровии (что подчёркивало приоритет открытия Провацека и Хальберштё-дтера); в качестве синонимов в источниках можно встретить бедсонии (названы в честь Бедсона, выделившего возбудителя пситтакоза) или миягаванёллы (в честь Миягавы, описавшего морфологию возбудителя венерической лимфогранулёмы). В настоящее время род включает 3 патогенных вида Chlamydia trachomatis (типовой вид рода), С. psittaci и С. pneumoniae; их современная классификация представлена в табл. 21-1.

 Жизненный цикл хламидий сложен, включает образование двух основных форм и обычно завершается в течение 40-72 ч. Элементарное тельце (ЭТ) — мелкая (0,15-0,2 мкм) инфекционная внеклеточная форма. Характеризуется полиморфизмом; метаболически малоактивно и адаптировано к внеклеточному выживанию (подавляет фагосомо-лизосомальное слияние). Непроницаемость, гидрофобность и устойчивость к осмотическим колебаниям клеточной мембраны элементарного тельца обусловливают дисульфидные мостики, соединяющие поверхностные белки. При эндоцитозе эти связи нарушаются, что приводит к снижению устойчивости клеточной стенки к различным воздействиям. Элементарные тельца обеспечивают передачу заболевания от человека (животного) к человеку (животному); способно к адсорбции на чувствительных эпителиальных клетках и проникновению в них посредством эндоцитоза. Адсорбционная активность бактерии реализуется через термолабильные эффекторные белки (структурно связаны с поверхностными Аг), комплементарные поверхностным структурам клеток, содержащим сиаловые кислоты. Переход элементарной формы в ретикулярную во многом вызван специфичностью главного поверхностного протеина хламидийной клетки. Ретикулярное тельце (РТ) - репродукционная внутриклеточная форма. Более крупное образование (до 1 мкм), чем ЭТ; развивается в течение 5-6 ч из ЭТ, проникшего в цитоплазму, претерпевшего структурные изменения (увеличение количества и размеров поли- и рибосом, а также генофора) и превратившегося в инициальное тельце (вегетативная форма). Трансформация в РТ начинается с восстановления дисульфидных связей поверхностных белков. После образования РТ хламидийная клетка начинает бинарно делиться; обычно продолжительность цикла размножения составляет 18-24 ч. Образуют тельца включений в виде вакуолей в цитоплазме, содержащих делящиеся РТ; обычно прилегают к ядру клетки, и их можно выявить микроскопией.

С. psittaci.

Возбудитель орнитоза; клиническая картина заболевания впервые описана Юр-генсёном (1875) у лиц, контактировавших с больными попугаями; в 1892 г. в Париже была зарегистрирована первая крупная вспышка, связанная с завозом больных попугаев (Psittacidae) из Аргентины (заболели 49 человек, 1.6 из них скончались), и по предложению Моранжа (1895) заболевание получило название пситтакоз. Позднее настоящая эпидемия заболевания разразилась в Европе (1929-1930), охватившая около 800 человек, летальность достигала 40%; заболеваемость связывали с многими домашними и дикими птицами, и по предложению Мёйера (1942) заболевание стали определять как орнитоз. Возбудитель был выделен Бэдсоном, Уэстёрном и Симпсоном (1930) из органов попугая, погибшего в Лондонском зоопарке; вскоре Бэдсон (1932) определил морфогенез и цикл развития микроорганизма, позднее названного в его честь (Bedsonia).

  Возбудитель. В настоящее время выделяют 1 серовар С. psittaci; жизненный цикл паразита не имеет определённых характерных особенностей и типичен для прочих хламидий; элементарные тельца округлой формы (0,2-0,35 мкм); образует множество телец включений, прилегающих к ядру поражённой клетки.

Клинические проявления. Инкубационный период 8-12 дней (может варьировать от 6 до 25 дней); заболевание всегда начинается остро — с ознобом, головной болью и миалгиями; температура тела быстро достигает 38-39 "С и носит ремиттирующий (в тяжёлых случаях постоянный) характер. В первые дни — выраженные боли в горле и пояснице, сухой кашель; позднее развиваются симптомы ларингита и трахеобронхита. Пневмония развивается к 8-12 дню; процесс локализован в нижних отделах, чаще справа. Лицо больного обычно гиперемировано (с инъекцией конъюнктивы и склер), на 3-4 сут у некоторых больных появляется кореподобная сыпь (пятна Хордера), возможны лимфаденопатия и увеличение печени (у трети пациентов наблюдают нарушения её функций). У 1/5 больных (чаще у лиц старше 30 лет) отмечают рецидивы на фоне неразрешившихся процессов в лёгких; они могут быть ранними (через 2-4 нед) и поздними (через 3-6 мес). До 12% случаев сопровождает хронизация процесса длительностью до 2-10 лет. В редких случаях у лиц с ревматическими поражениями или врождёнными пороками сердца развивается деструктивный эндокардит.

Лабораторная диагностика. В правильной постановке диагноза важны данные анамнеза о контактах с птицами. С. psittaci хорошо растёт в культурах L-клеток; все работы следует проводить только в специализированных лабораториях, т.к. возбудитель чрезвычайно вирулентен и риск лабораторного заражения очень высок. Образец ресуспендируют в сбалансированном стерильном физиологическом растворе и вносят в монослой индикаторных клеток. После инкубации в течение 1 ч при температуре 37 °С монослой отмывают и вносят среду для культивирования хламидий. При наличии в образце хламидий через 5-10 сут в монослое формируются цитолитические бляшки (зоны гибели клеток). Последние выявляют люминесцентной микроскопией после фиксации клеток метанолом и окраски родоспецифичес-кой антисывороткой, меченной флюоресцеином. Тем не менее в обычной практике выделение возбудителя не проводят. Основу диагностических подходов составляют методы серологической идентификации. Наиболее распространена РСК с сывороткой больного; титры AT, равные 1:32 и выше при соответствующей симптоматике, указывают на орнитоз. Увеличение титров AT обычно наблюдают к концу 2 нед заболевания. Следует помнить, что ранний приём антибиотиков способен отсрочить появление AT. Изредка наблюдают ложноположительные реакции у пациентов с болезнью легионеров. Предложены и более чувствительные методы диагностики — РИГА, прямая иммунофлюоресценция и др.